猪成纤维细胞脂质体或电穿孔转染pEGFP-N1条件的优化

论文摘要

我国是世界养猪第一大国，拥有丰富的地方猪种遗传资源，但是由于对本地和引进优良种猪的特色性能的发掘、利用效率和保护等工作相对薄弱、繁育工作滞后，均直接导致了良种基因资源没有被充分利用，严重制约了我国养猪生产的水平和效益，与世界养猪第一大国的位置很不相称。因此，以我国地方猪种遗传资源为基础，借助体细胞克隆、转基因、胚胎移植等现代生物技术，丰富资源保护、新品种培育手段，提高本地猪种利用率，实现本土化供种，减少引种数量，打破长期依赖从国外引种的怪圈，是我国养猪业可持续发展亟待攻克的重要课题之一。此外，开展猪体细胞克隆及转基因克隆研究不仅对畜牧业具有重大推动作用，也将为人类医学和生物学研究提供理想的动物模型。但是，转基因克隆猪的生产程序复杂、成本高、效率低下等不足制约着这一技术直接造福于人类。故此，为了利用细胞培养技术丰富地方猪种遗传资源保护手段，以及为转基因克隆猪生产提供丰富的体细胞素材，为创制猪转基因育种新材料奠定基础，本研究开展了以下实验：实验一以出生后30日龄的安庆六白猪耳部皮肤组织和处于妊娠期第40天左右的梅山猪胎儿组织为材料，采取组织块接种培养法或胰蛋白酶消化法分离培养成纤维细胞，并对所获得的细胞系的体外培养生物学特性进行了检测，包括细胞形态学观察和生长曲线绘制。结果表明：所获安庆六白猪和梅山猪的细胞系符合成纤维细胞的基本特征：细胞贴壁生长状态呈典型的梭型、星型或多边形，细胞之间连接紧密，成片生长，生长曲线呈典型的“S”状。通过组织块接种培养法或胰蛋白酶消化法，本试验共成功建立了4头雄性安庆六白猪和15头梅山猪胎儿的19个成纤维细胞系，为后续研究提供的丰富的材料。实验二以实验一建立的梅山猪胎儿成纤维细胞系（pigfetal fibroblasts cells,PFCs）为材料，探讨以脂质体介导pEGFP-N1转染梅山猪胎儿成纤维细胞的最佳条件，具体研究了脂质体(LipofectaminTM2000)和质粒（pEGFP-N1）DNA的比例、细胞密度、转染试剂盒处理细胞时间、血清添加与否等。发现在6孔板体系下，用LipofectamineTM2000转染梅山猪成纤维细胞系当细胞密度为80-90%时，质粒pEGFP-N1为4μg，LipofectamineTM2000加样量为8μl，转染过程中不含双抗和血清，在转染5小时后换上新鲜的不含抗生素的培养基，在此条件下，梅山猪转pEGFP-N1的效果最佳，转染效率约为30%-40%。实验三首先比较了梅山猪胎儿不同个体PFCs脂质体转染pEGFP-N1的效率。用实验二优化的转染方案对不同梅山猪转基因情况进行了研究，发现No.6和No.13猪的PFCs转染效率较高；其次，为探索建立两基因共转PFCs的方案，我们用LipofectamineTM2000将pEGFP-N1和DsRed两个商业化载体共同转染PFCs，发现当两个载体各为3μg时，转染效果最佳，而且所获PFCs表达绿色荧光时并不都表达红色荧光，但表达红色荧光的PFCs却都表达绿色荧光。实验四摸索了梅山猪PFCs电穿孔转染条件。采用BTX电转仪和InvitrogenNeonTM电转仪对梅山猪PFCs进行电转pEGFP-N1。以电击2d后的细胞存活率、发绿光比例为综合判定参数优劣。发现使用BTX电转仪的最佳参数为：场强170V/cm、脉冲时间15ms、脉冲1次；InvitrogenNeonTM的最优参数为：场强1400V/cm、脉冲时间30ms、脉冲1次。实验五以脂质体介导转染所获表达pEGFP-N1的梅山猪PFCs为供核生产克隆胚，并1-2细胞期的克隆胚移植给代孕母猪体内，200枚/头，共移植19头受体，其中1头受体怀孕期满产下4头克隆猪，经PCR检测有3头克隆仔猪携带EGFP基因。总之，本研究集成了组织块法、胰蛋白酶消化法及玻璃化冷冻技术，在猪上首次通过组织块胰蛋白酶消化、冷冻再复苏接种法建立了梅山猪PFCs；筛选出适于梅山猪PFCs的脂质体介导转基因方案，并成功获得转基因克隆猪；通过脂质体介导两基因共转梅山猪PFCs，获得阳性细胞系，为下一步制备多基因共转克隆猪奠定了基础；实验还表明不同品牌的电转仪介导梅山猪PFCs时最优参数不同，提示利用电转法制备转基因PFCs之前要对特定品牌电转仪的电转参数进行优化筛选。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 文献综述
• 1 转基因猪的主要生产方法
• 2 细胞分离培养技术简介
• 3 体细胞转染方法简介
• 4 常用的标记基因——绿色荧光蛋白
• 5 结语
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 溶液配制与分子试剂
• 1.1.2 引物合成和 DN A 测序
• 1.1.3 实验仪器及耗材
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 梅山猪胎儿成纤维细胞和六白猪耳缘成纤维细胞原代培养
• 1.2.2 六白猪耳缘成纤维细胞原代培养先胰蛋白酶消化组织块培养后再冻存
• 1.2.3 成纤维细胞传代培养
• 1.2.4 成纤维细胞冷冻保存
• 1.2.5 成纤维细胞解冻复苏
• 1.2.6 利用血球计数板和细胞计数器进行细胞计数
• 1.2.7 生长曲线绘制
• 1.2.8 质粒的制备
• 1.2.9 梅山猪成纤维细胞 G418 耐受分析实验步骤
• 1.2.10 脂质体转染梅山猪成纤维细胞
• 1.2.11 电击转染条件的优化
• 1.2.12 成纤维细胞转染后筛选
• 1.2.13 转基因猪成纤维细胞系 P CR 鉴定
• 1.2.14 转基因克隆猪的检测
• 2 结果
• 2.1 六白猪成纤维细胞观察结果
• 2.2 梅山猪成纤维细胞观察结果
• 2.3 细胞生长曲线
• 2.4 pEGFP-N1 质粒图和菌液PCR结果鉴定图
• 2.5 分光光度计检测质粒浓度和OD值
• 2.6 G418耐受分析实验
• 2.7 LipefectamineTM2000转染猪成纤维细胞条件的探索
• 2.8 不同梅山猪转基因情况的研究
• 2.9 梅山猪成纤维细胞质粒pEGFP-N1和DsRed共转
• 2.10 电击转染梅山猪成纤维细胞
• 2.11 转基因猪成纤维细胞系P CR 鉴定
• 3 讨论
• 3.1 关于组织块培养法和胰蛋白酶消化再培养法
• 3.2 关于组织块培养法和组织块冻存再培养法
• 3.3 关于胰蛋白酶冷消化和胰蛋白酶热消化法
• 3.4 关于梅山猪和六白猪体外增殖能力
• 3.5 梅山猪成纤维细胞对G418的耐受分析
• 3.6 梅山猪成纤维细胞脂质体转染条件的优化
• 3.7 克隆猪转基因检测结果分析
• 3.8 电穿孔转染细胞的条件研究
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介