鸡堆型艾美耳球虫3-1E基因的原核表达及多克隆抗体制备

论文摘要

鸡球虫病是危害养鸡业最严重的疾病之一,由球虫病造成的死亡和生产能力下降,给养鸡业带来巨大损失。目前,鸡球虫病的控制主要依赖于药物预防和治疗,由于球虫抗药性而导致的药物研发和使用费用巨大,以及在治疗过程中产生的药残等问题,使药物的使用受到限制。使用疫苗预防球虫病成为未来预防和控制球虫病的主要手段,目前利用基因工程技术开发球虫病疫苗已成为此病的研究热点,从而使球虫主要抗原性基因的研究显得尤为重要。本实验根据已发表的堆型艾美耳球虫（E. acervulina）3-1E基因序列设计引物,用反转录一聚合酶链式反应（Reverse-translation polymerase-chain reaction, RT-PCR）技术扩增出堆型艾美耳球虫上海株的3-1E基因,并进行序列测定。结果表明3-1E基因全长为513bp,含有一个开放阅读框架。与GenBank中登录的核苷酸序列进行比较,E. acervulina上海株3-1E与美国株、E. tenella GS株、E. acervulina QH株3-1E的cDNA的核苷酸同源性分别为100%、99.6%和99.2%,推导氨基酸同源性分别为100%、99.4%（第98位由缬氨酸变为异亮氨酸）和98.3%（第95位由苏氨酸变为异亮氨酸,第96位由精氨酸变为甘氨酸,第98位由缬氨酸变为异亮氨酸）。在克隆到堆型艾美耳球虫3-1E基因后,将此基因亚克隆至原核表达载体pET30a（+）中并转化到大肠杆菌BL21中,于37℃IPTG诱导培养获得表达,表达形式为融合蛋白。凝胶薄层灰度扫描显示表达的融合蛋白约占菌体蛋白的35%。SDS-PAGE和Western-blot分析显示,表达的3-1E融合蛋白分子量约为26Ku。利用镍离子亲和树脂进行纯化并免疫新西兰白兔,制备兔抗3-1E基因多克隆抗体。经琼脂扩散实验和Western-blot证明制备的多克隆抗体与3-1E融合蛋白具有良好的反应性。本实验成功克隆到堆型艾美耳球虫3-1E基因,并进行了原核表达,利用纯化的3-1E融合蛋白免疫兔制备了兔抗堆型艾美耳球虫3-1E基因多克隆抗体,为下一阶段3-1E基因生物学特性及其应用的研究打下了坚实基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 鸡球虫病的流行与危害
• 1.1.1 球虫的一般生物学特性
• 1.1.2 球虫的生活史
• 1.1.3 鸡球虫病的临床表现和危害
• 1.2 鸡球虫病的防治
• 1.2.1 常用的抗球虫药物
• 1.2.2 免疫预防
• 1.3 球虫的耐药性
• 1.3.1 球虫耐药性的产生机理
• 1.3.2 球虫耐药性的主要特点
• 1.3.3 提高防治效果的方法
• 1.3.4 实施药物与免疫接种联合应用
• 1.4 鸡球虫主要抗原基因的研究进展
• 1.4.1 管家基因
• 1.4.2 子孢子表面抗原基因
• 1.4.3 裂殖子表面抗原基因
• 1.4.4 折光体基因
• 1.4.5 微线蛋白基因
• 1.4.6 配子体抗原基因
• 1.4.7 其他相关的抗原分子基因
• 1.5 抗球虫疫苗的研究进展
• 1.5.1 球虫活苗
• 1.5.2 重组疫苗
• 1.5.3 亚单位苗
• 1.6 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与载体
• 2.1.2 实验动物和虫株
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 标准参照物
• 2.1.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）所用主要试剂
• 2.1.6 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 从鸡球虫卵囊中提取总RNA
• 2.2.2 RT-PCR 法扩增堆型艾美球虫3-1E 基因
• 2.2.3 PCR 扩增片段的克隆
• 2.2.4 重组质粒的鉴定
• 2.2.5 3-1E 基因重组表达载体的构建
• 2.2.6 重组质粒的鉴定
• 2.2.7 重组堆型艾美耳球虫3-1E 基因在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.2.8 免疫印记（Western-blot）分析
• 2.2.9 融合蛋白的纯化
• 2.2.10 多克隆抗体的制备
• 2.2.11 多克隆抗体的鉴定
• 3 结果
• 3.1 编码堆型艾美耳球虫3-1E 基因的克隆与序列测定
• 3.1.1 RT-PCR 堆型艾美耳球虫3-1E 基因cDNA
• 3.1.2 重组质粒 pMD18-3-1E 的鉴定
• 3.2 堆型艾美耳球虫3-1E 基因在大肠杆菌中的表达及多克隆抗体的制备
• 3.2.1 重组表达质粒的鉴定
• 3.2.2 融合蛋白的表达、鉴定与纯化
• 3.2.3 多克隆抗体的制备和鉴定
• 4 讨论
• 4.1 关于球虫卵囊的分离和纯化
• 4.2 3-1E 基因的克隆和序列分析
• 4.3 3-1E 基因的表达
• 4.4 多克隆抗体的制备
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文