聚合物接枝荷电介质的蛋白质吸附和辅助复性研究

论文摘要

聚合物接枝的离子交换色谱（IEC）介质比传统非接枝介质具有更高的吸附容量（Q）和传质速率（D），但其高容量吸附和快速传质机理还不清楚。本文围绕聚合物接枝的琼脂糖离子交换介质的性能和应用，开展了系统研究。首先研究了葡聚糖接枝对γ球蛋白在IEC和混合模式作用色谱（MMC）介质上吸附的影响。结果表明，在IEC中，Q值和D值均随葡聚糖接枝量增加而增加。这是由于带电葡聚糖层提供三维吸附空间有利于蛋白质吸附，葡聚糖层存在静电耦合等作用促进传质。在MMC中，Q值随葡聚糖接枝量增加而降低，而D值与接枝无关。这是由于疏水性较强的葡聚糖链相互结合导致接枝层塌缩，对传质无贡献。而且塌缩的葡聚糖层屏蔽了部分MMC配基，不利于蛋白质吸附。针对葡聚糖接枝介质中离子交换配基同时存在于接枝层与基质表面上的问题，本文制备了一系列不同离子交换容量（IC，100–1220mmol/L）的聚乙烯亚胺（PEI）接枝介质，以单独研究接枝层在蛋白质吸附中作用。结果表明，存在一个临界IC（cIC），Q值和D值在IC>cIC时快速增大。IC>cIC时，PEI链以其最少位点与琼脂糖连接，灵活的PEI链向孔内空间伸展，且临近的PEI链间距足够近使之彼此能够通过链振荡发生接触。因此，伸展的PEI链提供三维吸附空间，有利于蛋白质吸附；邻近的PEI链可通过链的摆动传递被吸附蛋白质而促进传质，即发生“链传递”作用。PEI接枝介质的Q值对离子强度（IS）的敏感程度低于传统非接枝介质，这是由于蛋白质可利用的孔体积随着IS增加而增加。PEI接枝介质的D值随IS增加先增加后减小。这是由于“链传递”作为一种表面扩散方式，同时依赖于蛋白质的吸附密度和吸附强度，这两个因素均与IS密切相关。在IC>cIC介质中，D值对IS的敏感程度明显大于在IC<cIC介质中。这也表明“链传递”作用的确对蛋白质在IC>cIC介质中的快速传质做出贡献。为拓展PEI接枝介质的应用，将PEI接枝介质应用于同电荷溶菌酶的氧化复性。系统研究了介质性质的影响，发现IC是影响介质辅助复性效果的首要因素，介质比表面也对复性收率有一定影响，但配基结构没有影响。在研究中还发现，Sepharose及以Sepharose为基质的阴离子交换色谱介质可微量吸附带正电的蛋白质，吸附容量可达60μg/mL。这种微量吸附是由于琼脂糖基质上残留的微量酸性基团。提高流动相盐浓度和介质电荷密度（如偶联PEI）可减弱这种吸附作用。本研究将推动聚合物接枝IEC介质的蛋白质吸附理论发展及其在生物分离中的应用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 蛋白质色谱技术
• 1.2.1 蛋白质色谱技术简介
• 1.2.2 离子交换色谱
• 1.3 色谱吸附理论
• 1.3.1 吸附热力学
• 1.3.2 吸附动力学
• 1.4 蛋白质色谱介质
• 1.4.1 制备型蛋白质色谱介质的发展方向
• 1.4.2 灌注色谱介质
• 1.4.3 接枝型色谱介质
• 1.5 蛋白质色谱复性
• 1.5.1 蛋白质折叠复性
• 1.5.2 辅助蛋白质折叠复性的方法
• 1.5.3 色谱辅助复性
• 1.6 本文主要研究内容
• 第二章 葡聚糖接枝层在离子交换吸附和混合模式吸附中的作用
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 葡聚糖接枝吸附剂的的制备
• 2.2.3 介质粒径的测定
• 2.2.4 介质湿密度的测定
• 2.2.5 有效孔隙率及总孔隙率的测定
• 2.2.6 葡聚糖接枝量的测定
• 2.2.7 配基密度测定
• 2.2.8 蛋白质吸附平衡实验
• 2.2.9 吸附动力学实验
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 介质基本物理性质
• 2.3.2 葡聚糖含量对离子交换色谱介质吸附性能的影响
• 2.3.3 葡聚糖含量对混合作用色谱介质吸附性能的影响
• 2.3.4 配基密度对混合作用色谱吸附介质性能的影响
• 2.3.5 pH 值对混合作用色谱介质吸附性能的影响
• 2.4 本章小结
• 第三章 离子交换容量对蛋白质在聚乙烯亚胺接枝介质上吸附行为的影响
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 聚乙烯亚胺接枝的 Sepharose FF 介质的制备
• 3.2.3 离子交换容量的测定
• 3.2.4 介质湿密度、总孔隙率、有效孔隙率和粒径的测定
• 3.2.5 反尺寸排阻色谱（iSEC）实验
• 3.2.6 蛋白质吸附平衡和吸附动力学实验
• 3.3 结果
• 3.3.1 介质的物理性质
• 3.3.2 吸附平衡
• 3.3.3 吸附动力学
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 离子强度对蛋白质在聚乙烯亚胺接枝介质上吸附行为的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 反尺寸排阻色谱、吸附平衡和吸附动力学实验
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 可利用孔空间
• 4.3.2 吸附平衡
• 4.3.3 吸附动力学
• 4.4 本章小结
• 第五章 聚乙烯亚胺接枝介质促进同电荷溶菌酶的氧化复性作用
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 聚乙烯亚胺接枝的 Sepharose FF 介质的制备
• 5.2.3 聚乙烯亚胺接枝的超孔介质的制备
• 5.2.4 介质湿密度、孔隙率、粒径、离子交换容量的测定
• 5.2.5 溶菌酶的变性和变性/还原
• 5.2.6 溶菌酶的复性
• 5.2.7 溶菌酶活性的测定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 介质的物理性质
• 5.3.2 离子交换容量对复性的影响
• 5.3.3 离子交换配基结构对复性的影响
• 5.3.4 介质粒径和孔径对复性的影响
• 5.4 本章小结
• 第六章 以 Sepharose 为基质的阴离子交换介质对溶菌酶的微量吸附作用
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 实验材料
• 6.2.2 蛋白质纯度的测定
• 6.2.3 柱色谱吸附实验
• 6.2.4 硫含量的分析
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 蛋白质在 Q Sepharose FF 上的吸附
• 6.3.2 盐浓度对溶菌酶吸附行为的影响
• 6.3.3 阳离子基团密度对溶菌酶吸附行为的影响
• 6.4 本章小结
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 主要创新点
• 7.3 展望
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 附录
• 致谢