Asp60对肌红蛋白结构和功能的影响

论文摘要

为了进一步了解肌红蛋白Mb表面第60位天冬氨酸对肌红蛋白结构和功能以及与Cu2+相互作用的影响,本论文以含有编码马心肌红蛋白双突变位点（第44位和60位天冬氨酸突变为赖氨酸）基因的表达质粒pGYM为模板,设计特异性突变引物,通过PCR定点突变的方法将第44位的碱性氨基酸赖氨酸（K）密码子突变成酸性氨基酸天冬氨酸（D）密码子,获得肌红蛋白突变体D60K的基因。将带有突变体的目的基因克隆连接到表达质粒pGYM上,经热激转化大肠杆菌BL21,大肠杆菌培养使突变蛋白D60K大量表达,收集菌体,酶法裂解细菌,并依次用硫酸铵沉淀、离子交换柱层析、凝胶柱层析分离纯化突变蛋白,其纯度可达96%。用圆二色谱和紫外-可见吸收光谱法分别研究野生型肌红蛋白Mb（WT）及突变体（D60K）的耐热、耐酸及耐盐酸胍诱导的变性过程,结果表明:用碱性氨基酸Lys取代酸性氨基酸Asp60,降低了肌红蛋白的耐热能力,导致其热变性中点温度Tm由68.1℃降低到66.4℃;提高了肌红蛋白的耐酸变性和耐盐酸胍变性能力,导致其变性中点（pH）1/2从4.32降到4.19、盐酸胍变性中点浓度Cm从1.95mM提高2.10mM。在研究突变位点对肌红蛋白与Cu2+相互作用的影响时,综合运用了紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、同步荧光光谱以及圆二色光谱。紫外-可见吸收光谱研究表明:Cu2+使Mb（D60K）的紫外吸收增强,峰位蓝移,疏水基团之间的作用力减弱;荧光光谱研究表明:Cu2+与Mb（D60K）相互作用时形成1:1的复合物且其猝灭机制属于静态猝灭,并由Van’t Hoff方程计算的ΔH、ΔS判断出二者之间的作用力主要表现为静电力,另外依据F（o|¨）rster非辐射能量转移理论计算出给体-受体间的结合距离为2.48 nm;同步荧光光谱研究表明,Cu2+使Mb（D60K）色氨酸残基的疏水性下降;CD光谱研究表明:加入Cu2+后,蛋白α-螺旋含量降低。以愈创木酚为底物分别测定了不同条件下Mb（WT）和Mb（D60K）的过氧化物酶活性,结果表明:Mb（D60K）的Km为2.19mM而Mb（WT）的Km为1.26mM。Mb（WT）和Mb（D60K）作为过氧化物酶的最适反应温度均为60℃左右,在相同温度下,Mb（D60K）的过氧化物酶活性低于Mb（WT）,且其作为过氧化物酶的热稳定性低于Mb（WT）。此外,两者作为过氧化物酶的最适反应pH均在5.5左右。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 肌红蛋白的结构
• 1.3 肌红蛋白结构和功能研究的现状
• 1.3.1 氨基酸选择性突变
• 1.3.2 血红素化学修饰
• 1.3.3 氨基酸选择突变和血红素修饰相结合
• 1.3.4 非天然辅基引入
• 1.3.5 电极上的直接电化学
• 1.3.6 与小分子或金属离子的相互作用
• 1.4 PCR定点突变
• 1.4.1 利用PCR在基因的5'或3'末端产生突变
• 1.4.2 利用重叠延伸PCR技术在基因的中心区段产生取代突变
• 1.5 蛋白的分离纯化方法
• 1.5.1 凝胶过滤层析（GC）
• 1.5.2 离子交换层析（IEC）
• 1.5.3 疏水作用层析（HIC）
• 1.5.4 金属离子亲和层析（IMAC）
• 1.6 蛋白质结构的研究方法
• 1.6.1 圆二色性光谱法
• 1.6.2 荧光光谱
• 1.6.3 紫外-可见吸收光谱
• 1.6.4 核磁共振法
• 1.6.5 X射线衍射结构分析法
• 1.7 本论文的工作
• 2 突变体Mb（D60K）的构建
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 实验试剂
• 2.2.3 培养基和储备液
• 2.2.4 引物的设计与合成
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 质粒提取
• 2.3.2 PCR定点突变
• 2.3.3 PCR产物的回收
• 2.3.4 酶切载体和目的基因
• 2.3.5 酶切反应物的精制
• 2.3.6 载体与目的基因的连接
• 2.3.7 感受态细胞的制备
• 2.3.8 转化
• 2.3.9 阳性克隆的筛选
• 2.3.10 DNA测序
• 2.4 结果与讨论
• 2.5 小结
• 3 突变体Mb（D60K）的表达、分离与纯化
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 实验仪器
• 3.2.2 实验试剂及缓冲液
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 蛋白质的表达
• 3.3.2 总蛋白溶液的获取
• 3.3.3 总蛋白的粗提
• 3.3.4 肌红蛋白的精制
• 3.4 肌红蛋白浓度的测定
• 3.5 结果与讨论
• 3.6 小结
• 4 肌红蛋白及其突变体（D60K）结构稳定性的研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 实验仪器
• 4.2.2 实验试剂
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 热诱导的Mb（WT）和Mb（D60K）的去折叠研究
• 4.3.2 pH介导的Mb（WT）和Mb（D60K）的去折叠研究
• 4.3.3 盐酸胍诱导的Mb（WT）和Mb（D60K）的去折叠研究
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 热诱导的Mb（WT）和Mb（D60K）的去折叠研究
• 4.4.2 pH介导的Mb（WT）和Mb（D60K）的去折叠研究
• 4.4.3 盐酸胍诱导的Mb（WT）和Mb（D60K）的去折叠研究
• 4.5 小结
• 2+相互作用的研究'>5 肌红蛋白突变体（D60K）与Cu²⁺相互作用的研究
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料
• 5.2.1 实验仪器
• 5.2.2 实验试剂
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 紫外-可见吸收光谱的测定
• 5.3.2 荧光光谱的测定
• 5.3.3 同步荧光光谱测定
• 5.3.4 圆二色光谱的测定
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 紫外-可见吸收光谱
• 5.4.2 荧光光谱
• 5.4.3 同步荧光光谱
• 5.4.4 圆二色光谱
• 5.5 小结
• 6 肌红蛋白及其突变体（D60K）过氧化物酶活性的研究
• 6.1 引言
• 6.2 实验材料
• 6.2.1 实验仪器
• 6.2.2 实验试剂
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 对愈创木酚Km值的测定
• 6.3.2 Mb（WT）及Mb（D60K）过氧化物酶的最适温度和热稳定性
• 6.3.3 Mb（WT）及Mb（D60K）过氧化物酶的最适pH和pH稳定性
• 6.4 结果与讨论
• 6.4.1 对愈创木酚Km值的测定
• 6.4.2 Mb（WT）及Mb（D60K）过氧化物酶的最适温度和热稳定性
• 6.4.3 Mb（WT）及Mb（D60K）过氧化物酶的最适pH和pH稳定性
• 6.5 小结
• 7 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 创新点
• 7.3 展望
• 参考文献
• 附录 缩略语表
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢