蛋白质微阵列载体表面修饰方法效果比较及其应用研究

论文摘要

目的：蛋白质微阵列载体的表面修饰是影响微阵列质量的关键因素之一,蛋白质微阵列载体不仅要求能高效固定目标蛋白,同时要求固定后的目标蛋白能够较好的保持原有的生物活性,能够高效的捕捉靶蛋白。到目前为止,对蛋白质微阵列载体表面的最佳修饰方法没有统一的观点。论文在总结前人研究成果的基础上,对三种微阵列载体的表面修饰方法的效果进行比较,进而选择效果较好的载体表面处理方法。同时,利用戊二醛表面修饰方法制备抗原微阵列,并将制备的抗原微阵列用于四种肝肿瘤标志物抗体的检测,验证蛋白质微阵列对多肿瘤标志物抗体联合检测的可行性,为后续多肿瘤标志物联合检测及光寻址电位传感器敏感膜的制备提供实验参考及理论支持。方法：采用分子自组装将常用的三种修饰方法,即3-氨基丙基-三甲氧基硅烷（（3-aminopropyl）trimethoxysilane, APTES）、戊二醛（glutaraldehyde, GA）、多聚-L-赖氨酸（poly-L-lysine, PLL）对芯片载体表面进行修饰,将Cy3标记羊抗鼠IgG固定在修饰后片基上,选择蛋白探针的固定率作为检测指标；将纯化的小鼠IgG作为探针固定在芯片上,靶蛋白为荧光素Cy3标记羊抗鼠IgG,选择蛋白探针的反应活性作为检测指标；将AFP、CEA、CA19-9和Fer同时固定在修饰后的微阵列载体上,制备抗原微阵列,采用间接ELISA原理对标准品所含的鼠源AFP、CEA、CA19-9和Fer抗体进行检测,达到四种肝肿瘤标志物抗体同时检测的目的。蛋白质微阵列孵育完成后,洗涤,通过ScanArray Gx生物芯片扫描仪检测反应后荧光强度,选择制备蛋白质芯片较佳的表面修饰方法,探讨采用蛋白质微阵列联合检测多种肿瘤标志物抗体的可行性。结果：对蛋白固定率研究中,戊二醛修饰后蛋白质微阵列载体对不同浓度目标蛋白的固定率在0.8～1.0,多聚赖氨酸和氨基硅烷试剂对目标蛋白的固定率大部分均小于0.5；对固相蛋白反应活性研究中,当Cy3标记羊抗鼠IgG的浓度小于5μg/mL时,戊二醛修饰后的玻片固定的蛋白质反应活性高于多聚-L-赖氨酸和氨基硅烷试剂修饰后的玻片,戊二醛修饰后制备的蛋白质微阵列载体上固相蛋白具有较强的捕捉游离互补蛋白的能力；采用蛋白质微阵列联合检测四种肝肿瘤标志物抗体时,可达到同时对样品中所含不同种抗体进行定性及半定量的分析,得到的荧光强度值基本与标准品中各不同组分的含量成正比关系。结论：课题建立了在该实验室进行蛋白质微阵列表面修饰的系统流程,确立了蛋白质微阵列载体表面修饰效果较好的方法,在该条件下制备的戊二醛修饰玻片在蛋白固定率及固定蛋白的反应活性方面具有较好的效果,与其他几种方法比较更适合于蛋白质微阵列的制备。使用戊二醛修饰后的玻片制备抗原微阵列,以四种肝肿瘤标志物抗体的检测为例进行了初步的实验研究,为多肿瘤标志物联合检测及后期光寻址电位传感器（LAPS）进行无标记抗体-抗原复合物检测的开发提供了数据参考,奠定检测基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、蛋白质微阵列载体表面修饰方法效果比较
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 试剂与仪器
• 1.1.2 氨基修饰
• 1.1.3 戊二醛修饰
• 1.1.4 多聚-L-赖氨酸修饰
• 1.1.5 蛋白质固定率的研究
• 1.1.6 固定蛋白质反应活性研究
• 1.2 结果
• 1.2.1 不同修饰方法对蛋白固定率的影响
• 1.2.2 不同修饰方法对固定蛋白反应性的影响
• 1.2.3 不同方法修饰玻片荧光强度变异系数比较
• 1.3 讨论
• 1.3.1 蛋白质微阵列载体及修饰方法选择
• 1.3.2 氨基、醛基基团及多聚赖氨酸对微阵列载体表面的影响
• 1.4 小结
• 二、用于肝肿瘤标志物抗体检测的蛋白微阵列的研制
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 试剂与仪器
• 2.1.2 间接ELISA法进行肝肿瘤标志物抗体的联合检测
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.3.1 蛋白质微阵列在免疫分析中的应用
• 2.3.2 无标记免疫芯片敏感膜的制备
• 2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 生物传感器载体选择及敏感膜制备的研究
• 综述参考文献
• 致谢