核因子κB在神经干细胞增殖过程中的调控作用

论文摘要

目的和意义:脑缺血及脑损伤是严重威胁人类生命健康的多发病,其主要的病理损害是神经元的损伤和缺失,导致神经功能缺损。直到上世纪90年代,神经再生与神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的发现为中枢神经系统损伤的修复带来了希望。NSCs具有强大的增殖能力和多分化潜能,病理情况下,内、外源性的NSCs能够增殖并向病灶区迁移,最终分化成各种类型的神经元和神经胶质细胞,以修复损伤的神经系统。但研究发现内、外源性NSCs的存活、增殖能力有限,并且易分化为胶质细胞;而微环境对NSCs的增殖、分化起着决定性作用。因而,如何调控NSCs的增殖及分化方向,是应用NSCs治疗神经系统疾病之前急需解决的问题。近年来研究发现,核因子-κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）信号系统与中枢神经系统疾病发生发展密切相关,并且可能参与了NSCs增殖分化的调控,但其确切机制尚不清楚。本实验通过观察NF-κB信号通路激活剂（肿瘤坏死因子α,tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）、NF-κB信号通路抑制剂（四氢化吡咯二硫代氨基甲酸盐,pyrrollidine dithiocarbamate,PDTC）对体外培养的NSCs增殖状况的影响,探讨NF-κB在NSCs增殖过程中的调控作用;同时初步探讨稀土化合物氯化镧（Lanthanum chloride,LaCl3）对体外培养的NSCs增殖状况的可能影响,以进一步了解NSCs增殖分化的调控机制,为更好地利用NSCs治疗神经系统疾病提供理论依据。方法:1、小鼠神经干细胞（mouse neural stem cells,mNSCs）的分离培养及鉴定:采用成球悬浮法分离培养mNSCs,至第三代后,行细胞冰冻切片,免疫组化方法鉴定NSCs标志蛋白nestin。2、实验分组:将生长状态良好的第3代mNSCs分为空白对照组、TNF-α组、PDTC组,分别采用常规NSCs培养液、含10ng/ml TNF-α的NSCs培养液、含0.1mmol/l PDTC的NSCs培养液培养30分钟、4小时和72小时;另设一组氯化镧组,以含氯化镧2.5μmol/L的NSCs培养液培养NSCs 13天。3、观察指标及方法:采用免疫荧光细胞化学方法及Western Blotting方法检测NSCs NF-κB活化状况（即P65在细胞中的分布变化）;采用免疫荧光细胞化学方法检测与细胞增殖相关的指标（包括CyclinD1、Ki-67）及神经球计数、神经球体积测量方法观察NSCs的增殖状况。结果:1、mNSCs的生长状况及鉴定结果:mNSCs原代培养时,镜下见培养2天后细胞分裂增殖逐渐形成呈悬浮生长的形态规则的神经球,球周边不断有分裂增殖的细胞凸出。57天后球体积不断增大,球中央的细胞因营养缺乏而逐渐变黑,予以传代。免疫细胞荧光法鉴定神经球中大部分为Nestin表达阳性细胞。2、NSCs的NF-κB活化状况:细胞免疫荧光染色结果显示,TNF-α组可见明显的p65活化由胞浆转位至胞核;而PDTC组P65仍表达在胞浆,未见核转位。Western Blotting结果显示,TNF-α组胞核NF-κB/p65蛋白含量显著高于对照组,而PDTC组胞核p65蛋白含量极少。结果表明,TNF-α能使mNSCs NF-κB活化。3、NSCs的增殖状况:神经球计数和神经球体积测量结果显示,TNF-α组和氯化镧（2.5μmol/L）组神经球数量分别为[（74.56±2.6）个/瓶]和[（62.32±2.8）个/瓶],较对照组[（42.28±3.5）个/瓶]明显增多,P<0.05;神经球体积分别为[（0.82±0.16）×106（μm3）]和[（0.66±0.12）×106（μm3）],较对照组[（0.26±0.08）×106（μm3）]明显增大,P<0.05。细胞免疫荧光染色结果显示,TNF-α组和空白对照组中,CyclinD1阳性细胞率分别为（68.6±4.2）%和（38.8±3.7）%,明显高于PDTC组的（24.2±2.8）%,p<0.01;Ki-67阳性细胞率分别为（48.2±3.6）%和（35.2±4.7）%,明显高于PDTC组的（18.7±1.8）%,p<0.01。以上研究结果表明,TNF-α可使mNSCsNF-κB活化,并促进NSCs增殖;PDTC能抑制mNSCs NF-κB的活化,从而抑制NSCs增殖;一定浓度的氯化镧可促进mNSCs增殖。结论:1、NF-κB的激活或抑制可促进或抑制NSCs的增殖,NF-κB在NSCs的增殖过程中可能起着重要的调控作用。2、一定浓度的氯化镧具有促进NSCs增殖的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 材料与方法
• 第3章 结果
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录A 实验图片
• 附录B 中英文缩略词表
• 附录C 综述
• 攻读学位期间的研究成果