作为细胞微载体的明胶缓释微球的制备及其性能研究

论文摘要

在组织工程中,能否提供足够数量的显性细胞是组织重建和修复中的一个重大难题。微载体技术则为这种细胞的培养提供了一个有效的方法。大量研究发现,与传统的平板培养法相比较,微载体技术更适合大量细胞的培养,该技术能有效的扩增细胞并增强细胞的显性表达。微载体的尺寸一般处于微米级,在悬浮培养体系中能够为单层细胞的生长繁殖提供较大的面积。因此,在细胞培养体系中,微载体材料的设计显得更为重要。明胶是由动物胶原水解得到的一种天然高分子材料。它具有可生物降解、生物适应性强、无毒副作用和非致癌性等优良性质。因此,近年来有许多关于明胶材料制备及其应用的研究报道。明胶能较大程度的保留其内所载物的生物活性,比较适合于仿ECM材料。在研究基于明胶材料的敷料中发现,附载有生长因子的明胶微球具有潜在的医用价值。生长因子主要作用是促进细胞的分化和提高细胞存活率,同时它能直接影响移植物周围的微环境,使其与周围环境更好的结合。但是,由于生长因子的半衰期较短,其应用受很大的限制。为此,我们制备了可生物降解的明胶微球,能持续释放生长因子,有效地克服了以上这些困难。本论文的研究内容主要包括以下三个方面:(1)以天然可降解高分子明胶材料为原材料,戊二醛作为交联剂,通过乳化冷凝法制备得到了微米级的明胶微球。实验结果表明,明胶水溶液浓度为25%、搅拌速度300 r/min、交联剂用0.1 mL 25%的戊二醛、表面活性剂用0.1 g span80是制备明胶微球的最优工艺条件。由此制备的明胶微球平均粒径约为250μm,呈圆球形,大小较均匀,微球的球面光滑,没有微孔和裂纹。明胶微球具有较好的缓释能力,其内所载的牛血清蛋白可以持续释放30 d,并且在药物释放过程中没有明显的突释现象。用该明胶微球悬浮培养软骨细胞,发现该明胶微载体适合软骨细胞的生长。软骨细胞在明胶微球上生长良好,分布均匀。(2)参照最优化工艺条件制备明胶微球。分别使用三种方法对明胶微球进行后处理:第一种处理方法是用丙酮和水洗涤处理;第二种处理方法是用丙酮和异丙醇洗涤处理;第三种处理方法是冷冻干燥法处理。从扫描电镜结果看出,三种不同的处理方法依次得到了表面光滑的明胶微球、表面皱褶的微球和具孔道结构的微球,三者的形貌差异较大。三种不同处理方法所得的明胶微球在溶胀40 min后基本达到溶胀平衡,但是冷冻干燥处理后的明胶微球,其溶胀度和溶胀速率明显高于另外两种明胶微球;三种明胶微球的体外降解性能没有明显的差别,在体外均可以完全降解,降解速度仅与明胶微球的粒径有关,明胶微球的粒径的越大降解的时间越长。用形貌各异的三种明胶微球作为微载体培养成纤维细胞,发现成纤维细胞在明胶微载体上生长情况良好,有明显的增殖现象。其中,用第三种处理方法得到的明胶微球的孔道结构及其适合成纤维细胞的黏附和生长,作为细胞微载体使用效果较好。(3)参照最优化工艺条件制备未交联的明胶微球,分别用戊二醛、紫外辐射和热固化等方法来交联微球,得到了三种不同交联方式的明胶微球:GGMs、UVGMs和TGMs。SEM结果表明不同的交联方法得到的明胶微球具有不同的外型。可以看到GGMs的表面光滑,UVGMs表面有不规则颗粒,TGMs表面凹凸不平。在体外实验中,我们研究了三种微球的降解性、生长因子缓释性、细胞增殖和细胞活性。结果表明:GGMs有较长的降解和缓释时间,有利于成纤维细胞的生长和增殖。虽然TGMs的累积释放生长因子最少,但是在短期内它也能够很好的培养细胞。由于UVGMs的降解变形太快,不适用于微载体,不利于细胞的培养。这一研究结果为明胶基微载体的实际应用带来一些帮助。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 组织工程用材料的特征和性质
• 1.2.1 人工细胞外基质（ECM）
• 1.2.2 支架材料
• 1.3 天然可降解材料在组织工程学中的应用
• 1.3.1 多糖类
• 1.3.2 蛋白质类
• 1.3.3 天然共混材料
• 1.3.4 结语
• 1.4 研究背景及研究思路
• 1.4.1 研究背景
• 1.4.2 研究思路
• 第2章 缓释性明胶微球的制备与其性能测定
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂与仪器
• 2.2.2 明胶微球的制备
• 2.2.3 明胶微球的表征
• 2.2.4 载BSA明胶微球缓释性能的测定
• 2.2.5 软骨细胞的培养
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 明胶微球的表观形貌
• 2.3.2 原明胶和未交联明胶的红外光谱
• 2.3.3 明胶微球的缓释性能
• 2.4 结论
• 第3章 表面形貌各异明胶微球的制备及其对细胞增殖的影响
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂与仪器
• 3.2.2 形貌各异的明胶微球的制备
• 3.2.3 明胶微球的表征
• 3.2.4 形貌各异的明胶微载体细胞学研究
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 形貌不同的明胶微球的表观形貌
• 3.3.2 明胶微球的溶胀性能
• 3.3.3 明胶微球的体外降解
• 3.3.4 形貌各异的明胶微球作为微载体的可行性研究
• 3.4 结论
• 第4章 化学交联、光辐射交联和热变性交联明胶微球的制备及其体外学评价
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂与仪器
• 4.2.2 未交联明胶微球的制备
• 4.2.3 明胶微球的交联
• 4.2.4 GGMs、TGMs和UVGMs的性能表征
• 4.2.5 GGMs、TGMs和UVGMs的体外细胞学研究
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 微球的形貌
• 4.3.2 GGMs、TGMs和UVGMs的体外降解性能
• 4.3.3 GGMs、TGMs和UVGMs的体外缓释性能
• 4.3.4 GGMs、TGMs和UVGMs作为微载体的可行性研究
• 4.4 结论
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果