产黄青霉C-4甲基固醇氧化酶基因启动子的功能分析

论文摘要

麦角固醇是真菌细胞膜的重要组成成分,在青霉素产生菌产黄青霉中,细胞膜中麦角固醇的含量被认为是影响青霉素分泌的重要因素。本实验室首次从产黄青霉中鉴别了两个麦角固醇生物合成的关键酶——C4甲基固醇氧化酶的编码基因,Pcerg25A和Pcerg25B,并对Pcerg25B基因的5’调控区进行了分析。为进一步研究产黄青霉中erg25基因的表达和调控机制,我们对Pcerg25A基因的5’调控区进行了研究。利用大肠杆菌β-半乳糖苷酶编码基因lacZ,构建了含有Pcerg25A基因的5’侧翼区1196bp片段报告载体并转入产黄青霉Wis54-1255,活性测定结果显示,该片段具备启动子转录活性。缺失突变体分析表明,与Pcerg25B基因启动子类似,在Pcerg25A基因5’侧翼区-1196--725bp间存在潜在的负调控元件,而在-725-196bp之间可能含有正调控元件。但Pcerg25A基因启动子仅具备基础转录能力,其调控的β-半乳糖苷酶活性仅为Pcerg25B启动子调控的六分之一。生物信息分析发现,Pcerg25A基因5’侧翼区缺少一些Pcerg25B侧翼区存在的SRE、E-box、及SRE-1等与固醇调控相关的顺式元件。通过构建Pcerg25A和Pcerg25B的杂合启动子,确认了Pcerg25B启动子-779bp--725bp间55bp序列的正调控功能。对该区域的点突变和缺失突变分析,将起增强作用的顺式元件进一步定位于38bp范围内。本研究为揭示Pcerg25基因的调控机制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 引言
• 1 综述
• 1.1 β-内酰胺类抗生素的发现
• 1.2 青霉素的合成
• 1.3 真菌中β-内酰胺类抗生素生物合成的调控
• 1.4 麦角固醇的研究概况
• 1.5 真核生物启动子的研究
• 2 Pcerg25A基因的5’侧翼区分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 Pcerg25A基因5’侧翼区转化载体的构建
• 2.2.2 产黄青霉转化结果
• 2.2.3 阳性克隆的鉴定
• 2.2.4 阳性菌株β-半乳糖苷酶活性测定
• 2.2.5 Pcerg25A 5’侧翼区序列转化载体的β-半乳糖苷酶活性分析
• 2.2.6 不同产黄青霉菌株中Pcerg25A和Pcerg25B的定量PCR分析
• 2.2.7 β-半乳糖苷酶活性测定条件的优化
• 2.3 讨论
• 3 Pcerg25A基因5’侧翼区核心区域的缺失分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 Pcerg25A 5’侧翼区序列缺失突变体转化载体的构建
• 3.2.2 Pcerg25A和Pcerg25B 5’侧翼区序列缺失突变体的活性比较
• 3.2.3 Pcerg25A和Pcerg25B 5’侧翼区序列生物信息学分析结果的比较
• 3.3 讨论
• 4 Pcerg25A和Pcerg25B的杂合启动子分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 杂合启动子突变体转化载体的构建
• 4.2.2 Pcerg25AB杂合启动子突变体β-半乳糖苷酶活性分析
• 4.2.3 55bp序列的生物信息学分析
• 4.2.4 点突变及55bp缺失突变体的β-半乳糖苷酶活性分析
• 4.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢