拟南芥β-罗勒烯合成酶基因AtTPS03的克隆及其植物过表达载体的构建

论文摘要

植物通讯（plant communication）是指植物与植物个体之间和植物与食草动物之间的信号跨空间传递以及信号接受个体对信号作出的生理应答和行为反应。植物受食草动物攻击后产生有机挥发性化合物,这种挥发物就起着跨空间信号传递的作用。植物释放的这些挥发物大多数是低分子的萜类化合物,包括单萜、倍半萜、同萜。（E）-β-罗勒烯（E-β-Ocimene）也是其中一种单萜挥发性有机物,是近年来发现的一种重要的植物通讯信号分子。现在已经了解到许多植物种类如:玉米、利玛豆、马玲薯、烟草、拟南芥、地中海棉、番茄等受草食动物取食后,都会释放出β-罗勒烯。为了进一步弄清楚罗勒烯作为信号分子的功能,我们根据GenBank中已发表的拟南芥β-罗勒烯基因AtTPS03的cDNA序列设计并合成了1对引物,通过RT-PCR方法从JA处理的拟南芥总RNA中扩增出AtTPS03基因的全长cDNA,通过测序和Blast比对,将与GenBank上公布的序列100%相同的片段连接到pCAMBIA1303表达载体上,构建成AtTPS03基因的植物过表达载体pCAtP35S。并通过GUS基因的瞬时表达检测证明了该过表达载体的构建成功。本研究的目的是希望促进罗勒烯合成酶基因在拟南芥中的组成型过表达,从而为进一步弄清楚罗勒烯作为信号分子的功能,了解植物与植物个体之间、植物与食草动物之间的信号跨空间传递以及信号接受个体对信号作出的生理应答和行为反应奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 植物通讯的研究进展
• 1.1 植物之间通讯的主要内容
• 1.2 植物通讯信号的传递
• 2 植食性昆虫诱导的挥发性有机成份在植物个体间通讯中的作用
• 2.1 植食性昆虫诱导的挥发性有机成份与植物防御植物防御
• 2.2 水杨酸诱导的植物防御
• 2.3 茉莉酸诱导的植物防御
• 2.4 昆虫分泌物诱导的植物防御
• 3 萜类化合物的研究进展
• 3.1 萜类化合物与植物通讯
• 3.2 萜类化合物的结构
• 3.3 萜类化合物的功能
• 3.4 萜类化合物的合成
• 3.5 MVA途径
• 3.6 DOXP/MEP途径
• 3.7 萜类合成酶
• 4 β—罗勒烯与植物通讯
• 5 本研究的创新点和意义
• 第二章 实验材料与方法
• 1.实验材料
• 1.1 菌种
• 1.2 质粒载体
• 1.3 植物材料
• 2.仪器设备
• 3.常用试剂药品的配制
• 3.1 培养基的配制
• 3.2 常用溶液的配制
• 3.3 各种酶及试剂
• 3.4 GUS染色液的配制
• 4.实验方法
• 4.1 双元表达载体的构建
• 4.1.1 PCR反应引物的设计
• 4.1.2 拟南芥总RNA提取与拟南芥cDNA的制备
• 4.1.2.1 拟南芥总RNA的提取
• 4.2.2.2 反转录反应
• 4.2.2 CTAB法提取DNA
• 4.2.3 PCR反应
• 4.2.4 试剂盒回收纯化琼脂糖中的DNA片段
• 4.2.5 PCR产物的测序和比对
• 4.2.5.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 4.2.5.2 DNA片段连接到T载体
• 4.2.5.3 试剂盒抽提纯化小量质粒
• 4.2.5.4 对转入DNA片段的T-载体进行酶切验证
• 4.2.5.5 对PCR产物进行测序、比对
• 4.2.6 表达载体转化大肠杆菌
• 4.2.6.1 PCR产物与质粒的连接
• 4.2.6.2 连接产物热激法转化大肠杆菌
• 4.2.7 表达载体转化进农杆菌
• 4.2.7.1 农杆菌感受态的制备
• 4.2.7.2 冻熔法转化根癌农杆菌
• 4.2.8 拟南芥的培养（栽培）
• 4.2.9 拟南芥的转化
• 4.2.9.1 农杆菌的扩大培养
• 4.2.9.2 浸花法转化拟南芥
• 4.2.10 转化子的筛选
• 4.2.10.1 筛选培养基浓度梯度筛选
• 4.2.10.2 转化子筛选培养基的配置
• 4.2.10.3 种子灭菌及转化子的筛选
• 4.2.11 GUS活性的组织化学检测
• 5 技术路线
• 第三章 实验结果与分析
• 1 拟南芥cDNA的制备
• 2 目的序列克隆与结果检测
• 2.1.菌落PCR与质粒酶切检测结果
• 2.2 序列分析
• 2.3 蛋白质序列比对
• 2.4 保守结构域分析
• 2.5 AtTPS03基因的蛋白质二级结构预测图
• 2.6 信号肽分析:
• 2.7 蛋白的跨膜结构域分析
• 2.8 等电点和分子量的分析
• 3 表达载体转化进大肠杆菌
• 3.1 表达载体转化进大肠杆菌后的质粒酶切结果
• 4 表达载体转化进农杆菌
• 5 GUS染色检测
• 6 拟南芥转化与抗性筛选结果
• 6.1 拟南芥潮霉素内源抗性的筛选
• 6.2 拟南芥浸花法转化
• 第四章 讨论
• 1.拟南芥RNA的提取
• 2.拟南芥的处理
• 3.组成型表达载体的构建
• 4.浸花法转化拟南芥的可能机制
• 5.转基因抗性苗的筛选
• 6.结论
• 参考文献
• 缩略语表
• 致谢
• 作者简介