论文摘要
喉癌（Laryngeal carcinoma）是一种常见的上呼吸道恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤的1％-8.4％，病理分型93％-99％为鳞状细胞癌。其发生发展是一个多步骤的过程，涉及多个相关基因结构和表达调控的改变。如：Ras、c-Myc、EGFR、Cyclin D1等瘤基因的扩增；抑瘤基因p53，Rb的突变。Cyclin D1是参与调控G1／S期检测点的重要蛋白之一，其功能是促进细胞由G1期向S期转化。如果Cyclin D1过量表达，将使细胞G1期缩短，导致细胞分化不足。Cyclin D1在多种实质性肿瘤表达增高，是多种头颈部鳞癌的分子标志。研究表明，Cyclin D1在喉癌组织表达量要明显高于正常粘膜，并且与病人生存率及病理分型具有明显的相关性。ZNF403又名DIF-3，可以在转录和表达水平抑制Cyclin D1的表达。该基因定位于人染色体17q12，位于17q12～21.1上的杂合性丢失的高频区域。编码697个氨基酸的具有指状结构域的蛋白。本实验室前期研究发现ZNF403 mRNA在喉癌组织中表达下调，可能与喉癌的发生相关。本研究拟从以下两个方面探讨ZNF403基因在喉癌组织中表达异常的机制。1．多种肿瘤细胞系及喉癌组织中ZNF403 mRNA的表达分析为了分析ZNF403是否与喉癌相关，我们选取了染色体17q存在缺失，突变和扩增的肿瘤细胞系和30例喉癌及配对的癌旁正常组织，采用半定量RT-PCR方法检测ZNF403 mRNA的表达。结果发现：喉癌细胞系Hep-2中ZNF403 mRNA的表达较其他肿瘤细胞低，而在30例喉癌及配对癌旁正常组织中有18例在喉癌组织中表达明显下调，另有2例在喉癌及配对癌旁组织中均检测不到ZNF403 mRNA的表达。ZNF403 mRNA在喉癌组织的表达下调与患者的年龄，TNM分期无关（p＞0.05）。2喉癌细胞系Hep-2及喉癌组织中ZNF403基因表达下调原因分析为了分析ZNF403基因在喉癌组织中ZNF403基因表达下调机制，我们首先选取了位于染色体17q12的三个STS（WI22201，WI16428，RH78009），其中WI16428位于ZNF403基因3’-UTR。WI22201，RH78009分别位于WI16428上下游。采用PCR-变性聚丙烯酰氨凝胶电泳的方法检测了30例喉癌及配对的癌旁正常组织中这3个位点的杂合性丢失（LOH）情况（若等位基因为纯合子，则记为无信息）。结果发现，30例喉癌组织中有3例在WI16428位点出现LOH（3／28），2例在RH78009位点出现LOH（2／29），无一例在WI22201位点出现LOH，但1例发生纯合性丢失。在发生LOH的喉癌组织中均出现ZNF403 mRNA的下调，但由于喉癌中LOH的频率较低，不能完全说明喉癌组织中ZNF403 mRNA下调的原因，提示LOH可能不是引起喉癌中ZNF403基因异常表达的主要因素。随后，我们通过生物信息学分析和荧光素酶报告基因实验证实，ZNF403基因启动子区域位于开放阅读框起点上游-1370至-607bp。该序列长764bp，富含CG。我们检测了30例喉癌及配对癌旁组织ZNF403基因启动子区CpG岛甲基化情况，结果显示：喉癌组织中ZNF403基因启动子区CpG岛的甲基化率为83％（25／30），在配对癌旁组织中的甲基化率为46.7％（14／30），喉癌组织中ZNF403基因启动子区甲基化率明显高于癌旁组织（P＜0.001），提示喉癌组织中ZNF403基因表达下调可能与其启动子的DNA甲基化相关。为了进一步分析ZNF403基因启动子区高甲基化与ZNF403基因mRNA表达的相关性，我们用甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2-脱氧胞苷处理的Hep-2细胞，通过RT-PCR和甲基化特异性PCR分别检测处理前后Hep-2细胞中ZNF403 mRNA的表达情况及其基因启动子区的甲基化状态。结果显示：Hep-2细胞经不同浓度的5-杂氮-2-脱氧胞苷处理24h后，ZNF403表达量逐渐上升。在1uM浓度处ZNF403表达量最高；同时发现，Hep-2细胞经5-Aza处理24h后，ZNF403基因CpG岛甲基化被抑制。综上所述，我们的研究表明：ZNF403在喉癌组织中表达明显下调。虽然杂合性丢失和CpG岛的甲基化对该基因失活都起了一定的作用，但启动子区CpG岛甲基化可能是ZNF403基因表达下调的主要原因。