应用蛋白芯片技术研究叶酸对体外缺氧胎鼠神经干细胞凋亡相关蛋白表达

论文摘要

目的探讨应用表面增强激光解离飞行时间质谱技术（surface-enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS）测试不同剂量叶酸（folic acid,FA）作用下缺氧胎鼠神经干细胞（Neural stem cells,NSCs）的蛋白质表达谱,从中筛选出差异表达蛋白,明确叶酸对其相关作用通路的保护机制。方法原代培养胎鼠神经干细胞,获得NSCs并分为5组：①正常对照组（Control）叶酸浓度为4μg/ml;②缺氧模型组（Hypoxia）叶酸浓度为4μg/ml；③缺氧叶酸低剂量组（Hypoxia+Folate-L）叶酸浓度为8μg/ml;④缺氧叶酸高剂量组（Hypoxia+Folate-H）叶酸浓度为44μg/ml;⑤缺氧叶酸缺乏组（Hypoxia+Folate-D）叶酸剂量为0.65μg/ml;于增殖第3d将除正常对照组外的其他4组细胞进行缺氧培养,8h后取出,继续培养至第7d收集增殖期细胞：细胞形态学观察；用台盼蓝染色计数缺氧损伤后的各组细胞密度；MTT法检测叶酸对细胞增殖状态的影响；采用弱阳离子交换芯片（WCX-2）蛋白芯片检测不同叶酸剂量下胎鼠NSCs蛋白表达差异；结果采用Biomarker Wizard软件进行分析,通过查询蛋白库,对特定分子质量所对应的标记蛋白进行初步确定；采用流式细胞术检测各组的凋亡率及细胞周期；采用Western blot方法检测各组NSCs MAPK信号通路相关蛋白（pERK1/2、pJNK1/2、P38）表达。结果经37℃,5%CO2、1%O2、94%N2条件缺氧8h后,NSCs形态及计数上都显示出损伤迹象,成功建立体外胎鼠NSCs缺氧损伤模型。MTT结果显示：每组隔天之间MTT值均有差别（P<0.05）。除24h时间点外,经SNK-q检验得出叶酸不同剂量组与对照组相比均有差别（P<0.05）,除Hypoxia+Folate-D组随时间MTTOD值呈下降趋势以外,其余四组随时间MTTOD值均呈上升趋势,之后有所下降。台盼蓝染色计数活细胞密度结果显示,Hypoxia组与其余四组差异有统计学意义（P<0.05）, Hypoxia+Folate-H组最高、Hypoxia+Folate-D组最低,差异均具有统计学意义（P<0.05）。流式细胞术（Flow cytometry, FCM）检测结果显示：Hvpoxia+Folate-L组的细胞凋亡率最低,Hvpoxia+Folate-D组凋亡率最高。细胞周期检测结果提示Hypoxia+Folate-H组的S期较活跃,Hypoxia+Folate-D组和Hypoxia组相较不活跃。蛋白芯片结果提示：叶酸补充可促进NSCs增殖；每组芯片上均捕获到81种蛋白质点,筛选出不同叶酸剂量组与Control组之间的差异蛋白共34种,其中有5个蛋白存在显著性差异（P<0.05）。初步推断这些蛋白与NSCs凋亡相关,且在不同叶酸剂量组图谱表达不同。Western blot结果显示,各组NSCs pERKl/2蛋白表达量与Control组相比差异均具有统计学意义（P<0.05）,其中Hypoxia+Folate-H组表达量最高（P<0.05）,Hypoxia+Folate-D组最低（P<0.05）。除与Control组和Hypoxia+Folate-L组差异无统计学意义外（P>0.05）,其余各组NSCs pJNK1/2蛋白表达差异均具有统计学意义（P<0.05）, Hypoxia+Folate-D组表达量最高（P<0.05）,Hypoxia+Folate-H组最低（P<0.05）。Hypoxia+Folate-D与Control、Hypoxia+Folate-L、Hypoxia+Folate-H组NSCs P38蛋白表达差异具有统计学意义（P<0.05）。结论本实验成功建立体外胎鼠NSCs缺氧模型,研究结果显示叶酸可以促进缺氧损伤的NSCs增殖,抑制或减缓细胞凋亡。叶酸可促进体外缺氧胎鼠NSCs内ERK蛋白表达同时抑制JNK、P38蛋白的表达,减少缺氧对体外胎鼠NSCs凋亡；在细胞周期的研究中提示叶酸可能对NSCs的蛋白合成及DNA酶的合成具有保护作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、蛋白芯片技术筛选叶酸对体外缺氧胎鼠NSCs凋亡的相关蛋白
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 NSCs培养鉴定
• 1.2.2 MTT法检测叶酸对缺氧条件下NSCs增殖的影响
• 1.2.3 缺氧培养细胞生长状况和细胞计数
• 1.2.4 缺氧培养细胞细胞凋亡率测定
• 1.2.5 叶酸对体外缺氧胎鼠NSCs细胞周期的影响
• 1.2.6 蛋白芯片图谱
• 1.3 讨论
• 1.3.1 叶酸对体外缺氧胎鼠NSCs凋亡的影响
• 1.3.2 叶酸对体外缺氧胎鼠NSCs凋亡的细胞周期的影响
• 1.3.3 蛋白芯片技术探寻叶酸对体外缺氧胎鼠NSCs凋亡相关机制
• 1.4 小结
• 二、叶酸对体外缺氧胎鼠NSCsMAPK信号通路相关蛋白表达影响
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 叶酸对体外缺氧胎鼠NSCs pERK1/2蛋白表达的影响
• 2.2.2 叶酸对体外缺氧胎鼠NSCs pJNK1/2蛋白表达的影响
• 2.2.3 叶酸对体外缺氧胎鼠NSCs p38蛋白表达的影响
• 2.3 讨论
• 叶酸对体外缺氧胎鼠NSCs MAPK信号通路相关蛋白表达的影响
• 2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 综述参考文献