罗格列酮对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织ⅠκB激酶β表达的作用研究

论文摘要

目的:非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis,NASH）是一种获得性代谢疾病,多由单纯性脂肪肝发展而来,当炎症持续存在,可发展为肝纤维化甚至肝硬化,是隐源性肝硬化的重要原因之一。IKK激酶复合物（Inhibit kappa B kinase complex,IKKs）属于丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶超家族成员,主要由三个亚单位组成:两个催化亚基IκB激酶β（inhibit kappa B kinase beta,IKKβ）和IκB激酶α（inhibit kappa B kinase alpha,IKKα）,一个调节亚基IκB激酶γ（inhibit kappa B kinase gamma,IKKγ/NEMO）。其中IKKβ是核因子-κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）激活所必需的,它参与炎症相关基因及抗凋亡基因的表达。最新的研究表明,它在肝脏、结肠、肺脏、骨组织中有表达,与炎症反应、细胞凋亡、胰岛素抵抗、脂肪肝、急性肝损伤等病理过程和疾病关系密切,但分子机制不清。曾民德报道胰岛素抵抗和脂肪组织脂解增高是非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）发病机制的中心环节。罗格列酮为噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂,其通过激活靶组织中的过氧化酶体增殖激活受体γ（peroxisome proliferators-activated receptor gamma,PPARγ）,来提高靶组织的胰岛素敏感性,改善胰岛素抵抗。本文旨在探讨IKKβ在NASH病理变化机制中的作用及PPARγ配体罗格列酮的影响效应,为了解NASH的发病机制和治疗提供依据。方法:选用雄性健康清洁级Wistar大鼠38只,体重140±10g,正常饲养一周后,随机分为正常对照组10只和高脂饮食组28只。正常对照组给予标准饲料;高脂组在标准饲料的基础上加入10%猪油、2%胆固醇和5%玉米油。于第16周股静脉放血处死正常对照组大鼠2只和高脂饮食组大鼠4只,观察肝脏的颜色、质地,留取肝组织标本,经HE染色证实NASH大鼠模型形成。正常对照组余8只大鼠继续给予标准饲料喂养,高脂饮食组另24只随机分为模型对照组、高剂量治疗组（罗格列酮4mg/kg·d）、低剂量治疗组（罗格列酮1mg/kg·d）,每组各8只,于28周末一并处死四组大鼠共32只,留取血清,以备血清学检查。取肝右叶组织3块,分别用于快速冰冻切片,行SudanⅣ染色,观察肝细胞脂变情况;10%的甲醛固定用于HE染色及Masson染色,观察肝组织的炎症、脂肪变性及纤维化程度;4%多聚甲醛固定用于IKKβ免疫组化染色,观察肝组织IKKβ的表达;余肝组织经液氮速冻后置于-80℃冰箱,用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription- polymerase chain reaction,RT-PCR）观察大鼠肝组织IKKβmRNA的表达。用日本Olympus AU2700全自动生化分析仪检测血清胆固醇（cholesterol,TC）,甘油三酯（triglyceride,TG）,丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）,天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）;用ELISA双抗体夹心法测定血清肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）表达量。HE染色观察肝组织普通病理变化;SudanⅣ染色观察肝细胞脂变的程度;Masson三重染色观察肝纤维化程度;采用Power Envision两步法对肝组织标本进行IKKβ免疫组化染色。用多功能图像分析仪测定IKKβ表达面积百分比,每张切片取四周及中央五个区域,20倍物镜下计算平均面密度（阳性面积与统计场面积百分比）,结果取平均值。用SAS10.0统计软件处理所有数据,计量资料采用x±s表示,采用单因素方差分析前进行方差齐性检验,Student-Newman-Keuls法进行组间比较。相关性分析用直线相关分析法。结果:1大鼠的一般表现:正常对照组大鼠皮毛有光泽、活泼,体重逐渐增加,模型组较正常对照组大鼠体重增加明显,治疗组大鼠体重增加减慢。28周末,正常大鼠肝脏外观呈红褐色,明亮有光泽;模型组大鼠肝脏颜色呈浅黄或土黄色,切面油腻感,无光泽。治疗组大鼠肝脏颜色呈淡黄色,较有光泽。2血清学指标的变化:与正常对照组相比,模型组大鼠血清胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、丙氨酸氨基转氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基转氨酶（AST）、血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平显著增高（P<0.01）;与模型组相比,治疗组血清生化指标及TNF-α水平显著下降（P<0.01）。3肝组织病理学变化及免疫组织化学:光镜下,正常对照组大鼠肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列,SudanⅣ染色肝细胞胞浆呈天蓝色,Masson三重染色示中央静脉及汇管区未见明显胶原纤维。模型对照组大鼠肝细胞均出现中、重度的脂肪变性,伴有小叶内炎症及汇管区炎症,还有点状或灶状坏死,部分出现窦周及中央静脉纤维化,SudanⅣ染色可见脂变的肝细胞胞浆中有密布散在的红色颗粒,肝细胞内有不同程度炎症。治疗组呈现脂变及炎症程度显著减低,未见明显纤维化。正常对照组大鼠肝组织免疫组化染色可见IKKβ在胞浆有弱表达,表达部位呈浅黄色,IKKβ相对含量为6.78±8.87。与正常对照组相比,模型组大鼠肝组织表达IKKβ的肝细胞数明显增多,且主要表达在肝细胞核,阳性部位呈深棕黄色,IKKβ相对含量为47.93±11.72。与模型对照组相比,治疗组大鼠肝组织IKKβ表达的相对含量显著降低为33.68±6.74 ,以高剂量治疗组的变化为著为20.65±5.91（P<0.01）。4相关性分析:各组大鼠肝组织IKKβmRNA表达与血清TNF-α水平呈正相关（r值分别为0.940、0.762、0.973、0.947,P值分别为<0.01、<0.05、<0.01、<0.01）,模型组与高剂量治疗组IKKβmRNA表达与血清ALT、AST水平正相关（r值分别为0.772、0.810、0.720、0.842,P值分别为<0.05、<0.05、<0.05、<0.01）。结论:1应用高脂饮食的方法可以成功制备NASH大鼠模型,脂代谢紊乱是NASH发生和发展的重要机制。2模型组大鼠肝组织IKKβ表达、血清TNF-α水平显著高于正常对照组,与血清ALT、AST水平呈正相关,而与肝纤维化程度无关。表明NASH发病机制中IKKβ促进TNF-α释放,导致IKKβ-TNF-α恶性循环,促进胰岛素抵抗的发生发展。3治疗组大鼠肝组织IKKβ表达、血清TNF-α水平较模型对照组显著下降,与血清ALT、AST水平呈正相关。提示罗格列酮可抑制IKKβ的表达,减少TNF-α的产生和释放,阻断IKKβ-TNF-α恶性循环,改善胰岛素抵抗,阻断NASH的发生发展。这为临床上应用PPARγ激动剂治疗NASH提供了理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 罗格列酮对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织IκB激酶β表达的作用研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 IκB 激酶-β与慢性肝病
• 致谢
• 个人简历