灰额刺尾鱼（Acanthurus glaucopareiu）溃疡病病原分离及其胞外产物的研究

论文摘要

近年来,海水观赏鱼越来越受到人们的青睐,灰额刺尾鱼（Acanthurus glaucopareius）作为一种常见的海水观赏鱼,以其艳丽的色彩、优美的体形而倍受人们的喜爱,然而由于养殖过程中的疏忽及防病意识的淡泊,导致大量鱼病的出现。灰额刺尾鱼溃疡病作为一种典型的疾病,本试验从临床病症上诊断灰额刺尾鱼溃疡病,并对该病的病原学进行研究,检测胞外产物是否为该病的毒力因子,为以后的养殖生产提供更多的理论依据。海南某观赏鱼场中,灰额刺尾鱼出现行动迟缓,食欲减退,体表溃烂,鱼鳍伴有充血现象,眼球突出,晶体混浊,角膜溃烂,肠道内无内容物,肝脏肿胀,肾脏肿大,肛门红肿等病症。从灰额刺尾鱼体表溃烂处及鳃部采样显微镜镜检,未发现有寄生虫寄生,尾静脉采血用Giemsa染色法制作血涂片,观察到有白细胞数量增多。再从体表溃烂处及内部器官中分离到五株有较强致病力的菌株,人工回归感染试验选用注射和浸泡两种方式,感染浓度都为3×108CFU/mL,结果表明浸染组的感染率为75%,而注射组为100%。从人工感染发病的灰额刺尾鱼病灶部位再次分离的优势菌与其菌株C100311的生理生化性质一致,回归感染灰额刺尾鱼后仍能出现与自然发病情况下相同的症状,结果表明菌株C100311为致病菌。对该病原菌进行了形态、生理生化反应测试,其主要特征为革兰氏阴性,具动力的短杆菌,无芽孢。生理生化试验及Biolog全自动微生物鉴定系统结果显示为溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）。应用细菌16S rDNA的通用引物对该菌基因组DNA进行PCR扩增、克隆测序,得到1条长度为1392bp的核苷酸序列,该序列与溶藻弧菌（登录号GQ455008）的16S rDNA基因序列同源性达99%,进一步确定该致病菌为溶藻弧菌。采用纸片法进行药敏试验,结果表明,该菌株对痢特灵、氟哌酸、环丙沙星等药物敏感,该菌株对甲氧胺嘧啶、氨苄青霉素、阿米卡星、青霉素等药物耐药。采用玻璃纸平板覆盖法提取菌株C100311的胞外产物（ECP）,用PBS洗下培养物,离心后上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤制备了胞外产物粗提液。用双层纸片法鉴定该胞外产物具有蛋白酶、淀粉酶及溶血性。首先确定硫酸铵的最适饱和度为70%,利用硫酸铵盐析、Sephadex G-25凝胶层析及Microcon超滤离心管浓缩等蛋白纯化步骤后,ECP粗提液经过Sephadex G-25凝胶过滤层析,洗脱曲线有一个蛋白吸收峰,收集该峰的洗脱液。采用考马斯蓝法测定蛋白含量,以偶氮酪蛋白底物测定酶活力,测定纯化倍数为3.62,产率为19.0%。再经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）得到一分子量为33kD的胞外蛋白酶（ECPase）,将浓缩蛋白以2倍倍比稀释法对灰额刺尾鱼进行致病性研究,结果表明该致病该蛋白酶对灰额刺尾鱼有一定的致病性,蛋白浓度为0.836mg/mL时,肌肉注射灰额刺尾鱼8小时后,开始陆续出现死亡,注射处出现明显的溃疡病灶,局部肌肉溶解坏死,死亡率达87.5%。蛋白浓度为0.104mg/mL时,肌肉注射灰额刺尾鱼后,逐步出现食欲下降、行动迟缓、反应迟钝等症状,死亡率仅为12.5%,对灰额刺尾鱼的半数致死浓度达到0.63μg/g体重,证明溶藻弧菌的胞外蛋白酶是一种毒力因子。菌株C100311的胞外蛋白酶能被苯甲基磺酰氟（PMSF）完全抑制酶活性,说明该蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶。该酶最适反应温度为50℃,对热不稳定,最适pH为9,最适温度范围为30-50℃,最适pH范围为8-10,符合灰额刺尾鱼的生长环境。不被SDS、EDTA、Urea抑制酶活力,Mg2+、Ca2+能轻微提高酶活力,Zn2+、Cu2+、Fe2+离子则能显著地降低酶活力,这为临床用药提供了指导作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 海洋观赏水族的细菌性疾病及胞外产物的研究进展
• 1. 海水观赏水族的细菌性疾病与控制
• 1.1 海水观赏鱼的细菌性疾病与防治
• 1.1.1 弧菌病（Vibriosis）
• 1.1.2 美人鱼发光杆菌杀鱼亚种病（Photobacterium damselae piscicida）
• 1.1.3 链球菌病（Streptococcicosis）
• 1.1.4 分枝杆菌病（Mycobacteriosis）
• 1.2 观赏珊瑚的细菌性疾病及防治
• 1.2.1 白化病（Bleaching）
• 1.2.2 黑带病（Black band disease,BBD）
• 1.2.3 白带病（White band disease,WBD）
• 1.2.4 白色瘟疫（White plague disease）
• 1.2.5 曲霉病（Aspergilosis）
• 1.2.6 白斑病（White pox disease）
• 1.2.7 黄带病（Yellow band disease）
• 1.2.8 珊瑚疾病控制方法
• 1.2.8.1 化学方法
• 1.2.8.2 噬菌体治疗
• 1.2.8.3 产生抗菌体
• 1.3 其他海洋生物常见细菌性疾病
• 2. 海洋病原菌胞外产物的研究
• 2.1 胞外酶
• 2.2 溶血素
• 2.3 其他胞外因子
• 3. 海洋生物疾病的研究前景
• 第二章 灰额刺尾鱼溃疡病临床诊断与病原分离鉴定
• 1. 材料与方法
• 1.1 主要仪器与试剂
• 1.2 试验动物
• 1.3 临床诊断
• 1.4 病原分离
• 1.5 人工感染试验
• 1.6 细菌形态观察及生理生化试验
• 1.7 BIOLOG 全自动微生物鉴定系统鉴定
• 1.8 药敏试验
• 1.9 16S rDNA 序列测定与分析
• 2. 结果
• 2.1 临床诊断
• 2.2 菌落形态特征
• 2.3 人工感染试验结果
• 2.4 生理生化特征
• 2.5 BIOLOG 细菌鉴定结果
• 2.6 16S rDNA 序列测定与分析结果
• 2.7 药敏试验结果
• 3. 讨论
• 3.1 灰额刺尾鱼溃疡病的病症及临床诊断
• 3.2 灰额刺尾鱼溃疡病的病原和病因
• 3.3 灰额刺尾鱼溃疡病的临床治疗方法
• 第三章 灰额刺尾鱼源溶藻弧菌胞外蛋白酶提纯及致病性研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 主要试验材料
• 1.2 胞外产物（ECP）中酶及溶血素的检测
• 1.3 胞外蛋白酶的分离与纯化
• 1.3.1 透析袋的处理
• 1.3.2 硫酸铵最适饱和度的确定
• 1.3.3 硫酸铵盐析
• 1.3.4 Sephadex G-25 层析
• 1.4 SDS - PAGE 电泳
• 1.5 蛋白含量的测定
• 1.6 胞外蛋白酶活力测定
• 1.7 胞外蛋白酶的致病性
• 2. 结果
• 2.1 ECP 中酶及溶血素的检测
• 2.2 硫酸铵最适饱和度的确定
• 2.3 胞外蛋白酶的分离纯化
• 2.4 SDS - PAGE 图谱
• 2.5 胞外蛋白酶致病性
• 3. 讨论
• 3.1 胞外蛋白酶的纯化方法
• 3.2 胞外蛋白酶的成分
• 3.3 胞外蛋白酶的致病性
• 第四章 灰额刺尾鱼源溶藻弧菌胞外蛋白酶的特性研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 主要试验材料
• 1.1.1 试验试剂
• 1.1.2 缓冲液配制
• 1.2 蛋白酶的分离与纯化
• 1.3 蛋白含量测定
• 1.4 产酶的时间优化
• 1.5 酶的最适反应温度测定
• 1.6 酶的热稳定性测定
• 1.7 酶的最适pH 测定
• 1.8 酶的抑制试验
• 2. 结果
• 2.1 产酶的时间优化
• 2.2 酶的最适反应温度和酶的热稳定性
• 2.3 酶的最适pH
• 2.4 酶的抑制试验
• 3. 讨论
• 3.1 温度及pH 对胞外蛋白酶的影响
• 3.2 金属离子及抑制剂对胞外蛋白酶的影响
• 参考文献
• 致谢
• 研究亮点
• 硕士期间发表的学术论文