论文摘要
类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种自身免疫性疾病,其主要病理特点是滑膜细胞增生,衬里层增厚,炎细胞浸润,以及软骨和骨组织的破坏,最终导致关节畸形和功能障碍。关节软骨和骨组织的破坏是致残的根本原因,积极寻找导致关节软骨破坏及骨组织病理生理改变的关键环节是防治该病的重点。软骨细胞本身的代谢对关节软骨细胞外基质（extracellar matrix,ECM）合成以及修复中起关键作用。组织酸化影响关节软骨细胞生长代谢,细胞外pH降低,可以激活与关节软骨破坏相关的基质金属蛋白酶。但软骨细胞是通过何种途径来感受周围环境pH的变化呢?研究表明,对于胞外pH的变化,细胞可以通过酸敏感离子通道（acid sensing ion channels,ASICs）途径去感受胞外的pH改变。ASICs是一类由胞外酸化所激活的阳离子通道,近年来对ASICs的研究发展非常迅速,因其具有广泛的生物学功能和重要的病理学意义而备受关注。研究表明ASICs在脑缺血、癫痫、肿瘤等伴有局部组织酸化的病理过程中发挥重要作用。RA由于炎症导致关节局部组织酸化与脑缺血等导致的酸中毒具有相似的病理特点,那么,关节软骨细胞是否存在ASICs?ASICs是否在RA关节软骨破坏过程中发挥作用?组织酸化是炎症病理下常见的现象,但对ASICs是否参与由组织酸化诱导关节软骨损伤的病理生理过程,以及抑制或阻断ASICs对炎症损伤的关节软骨是否有保护作用尚不清楚。为进一步探讨ASICs在RA关节软骨细胞中的作用。本实验以弗氏完全佐剂（Complete Freund′s Adjuvant,CFA）诱导佐剂性关节炎（adjuvant-inducedarthritis,AA）大鼠模型为研究对象,研究AA大鼠关节软骨细胞中ASICs的表达与部分功能。具体研究内容包括以下四个部分:1.大鼠关节软骨ASICs的表达利用RT-PCR和Western blot检测ASICs在大鼠关节软骨的表达。结果显示大鼠关节软骨存在ASIC1a、ASIC2a和ASIC3mRNA及其蛋白的表达。半定量分析表明ASIC1amRNA在大鼠关节软骨的表达水平高于其它亚基。提示关节软骨细胞存在ASICs,可能参与关节软骨细胞的代谢过程。2.AA大鼠关节软骨ASICs的表达大鼠右侧后足跖皮内注射CFA,诱导AA大鼠模型。用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测ASICs在AA大鼠关节软骨的表达。经半定量分析,AA大鼠关节软骨中表达高水平的ASIC1a、ASIC2a和ASIC3mRNA,与模型组比较,差异有统计学意义（P＜0.01）;Western blot检测显示蛋白表达的变化与mRNA变化一致。结果提示AA大鼠关节软骨中ASICs的表达增多,参与病理情况下关节软骨的代谢过程。3.常用RA药物对AA大鼠关节软骨细胞ASICs的影响及作用48只大鼠,随机分成正常组,AA模型组,阿司匹林(50 mg.kg-1)组,地塞米松(0.2 mg.kg-1)组,雷公藤多苷(50 mg.kg-1)组和左旋咪唑(10 mg.kg-1)组。CFA致炎后d10起,AA大鼠出现继发性炎症,此时地塞米松组采用腹腔注射,其它用药组分别灌胃给药,正常组与模型组灌等容量的无菌注射用水,连续7d。实时荧光定量PCR和Western blot分析显示阿司匹林能显著抑制AA大鼠关节软骨细胞ASICs mRNA和蛋白的表达（P＜0.01）,其它用药组对ASICs无明显抑制作用,与模型组比较,无明显差异（P＞0.05）。各用药组能明显升高AA大鼠关节软骨细胞外基质（ECM）成分Ⅱ型胶原和aggrcan表达量,其中阿司匹林作用最显著。以上结果提示:抑制关节软骨细胞ASICs的表达对关节软骨具有保护作用,ASICs可能参与RA关节软骨破坏。4.ASICs阻断剂amiloride对AA大鼠关节软骨损伤的影响40只大鼠,随机分成正常组,AA模型组,amiloride(5 mg.kg-1)组,阿司匹林(50 mg.kg-1)组+amiloride(5 mg.kg-1)组,阿司匹林(50 mg.kg-1)组。足容积法测量继发侧足肿胀度;病理组织学检查结果显示各用药组关节软骨损伤明显改善;实时荧光定量PCR观察ASICs阻断剂amiloride能抑制AA大鼠关节软骨细胞ASICsmRNA的表达,其中阿司匹林合并amiloride组抑制最为显著;免疫组化和alcian蓝染色分别检测ECMⅡ型胶原和蛋白多糖的变化,结果显示各用药组均明显升高ECMⅡ型胶原和蛋白多糖蛋的表达,其中阿司匹林合并amiloride组作用最为显著（P＜0.01）。通过离体细胞实验,用激光共聚焦显微镜（Fura-3/AM）检测细胞Ca2+浓度的方法,分析胞外不同浓度pH值和阻断剂amiloride对关节软骨细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的影响。结果表明细胞外pH（6.5,pH6.5）可使关节软骨细胞内Ca2+水平短暂性升高,amiloride能明显抑制pH6.5诱导的关节软骨胞内Ca2+水平。以上结果提示:ASICs阻断剂amiloride对大鼠关节软骨损伤具有保护作用,其机制可能通过阻断酸敏感离子通道,抑制Ca2+超载,减轻软骨细胞损伤,从而保护关节软骨。
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