百合花发育相关基因的组织原位杂交研究

论文摘要

基因表达的组织原位杂交定位是现代分子生物学的重要研究方法。本研究以麝香百合不同发育时期花器官为材料,详细探讨组织原位杂交的细节,建立适用于麝香百合的原位杂交体系。制备百合花发育基因LLGLO1和LLTCP1 RNA探针,在百合花器官切片上进行原位杂交,研究二者在百合花器官中的时空表达模式。具体研究内容如下:1.取材、固定对RNA保存的影响。离体1.5h的材料RNA仍然保存完整,因此取材、固定等后续处理应在1.5h之内完成。SDS改进法和蛋白酶K法提取FAA、卡诺、4% PFA固定、石蜡包埋、冷冻保存材料的总RNA说明卡诺使材料RNA完整性至少维持两个月,在实验过程中以卡诺处理为标准,排除人为操作造成RNA降解。2.RNA探针制备。用LLGLO1基因的特异片段构建至含T7启动子的载体,体外转录获得地高辛标记的反义RNA探针,斑点检测法检测探针标记效率。结果显示PCR制备模板效率较高。3.蛋白酶消化条件确定。分别对蛋白酶消化的浓度和时间进行实验,表明百合花器官切片可选择10μg/mL的蛋白酶K在37℃消化20~30min。4.切片方式和固定液选择。研究结果表明,石蜡切片在组织完整性和信号显示性上表现良好,而冰冻切片则较差;沉淀性固定剂和交联性固定剂固定材料杂交信号出现的部位大致相同,但是前者的信号强度在某些部位不及后者,并且沉淀性固定剂可能会丢失部分信号。5.LLGLO1和LLTCP1基因的时空表达模式。研究结果显示LLGLO1在四轮花器官中均有表达,2cm和3cm时期表达量高于0.5cm和1cm时期,说明随着花器官的成熟,其在各轮花器官中的表达量逐渐增加;LLTCP1的表达模式与TCP家族的其他基因类似,集中在细胞分裂旺盛的组织中,可能与调节细胞的生长和分裂有关。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1. 花发育概述
• 1.1 花的形成
• 1.2 花器官发育的ABC 模型
• 1.3 ABC 模型的延伸
• 1.4 花器官特征决定的分子机制
• 1.5 单子叶植物的ABC 模型
• 1.6 参与植物三维形态建成的TCP 家族基因
• 2. 植物RNA 原位杂交技术研究
• 2.1 原位杂交技术的发展
• 2.2 RNA 原位杂交技术的基本原理
• 2.3 探针的种类
• 2.4 探针的标记
• 2.5 植物RNA 原位杂交技术的发展及其应用
• 2.6 RNA 原位杂交的应用前景
• 3. 本研究的目的及意义
• 第二章 麝香百合花器官原位杂交体系的建立
• 1. 研究材料
• 1.1 实验材料
• 1.2 基因来源
• 1.3 实验仪器和药品
• 2. 实验方法
• 2.1 材料处理及RNA 保存
• 2.2 RNA 探针的制备
• 2.3 蛋白酶消化条件的摸索
• 2.4 原位杂交
• 3. 实验结果与分析
• 3.1 材料RNA 的保存情况
• 3.2 探针的制备
• 3.3 蛋白酶消化条件摸索结果
• 3.4 原位杂交结果
• 4. 讨论
• 4.1 材料处理方法的选择
• 4.2 探针制备
• 4.3 原位杂交
• 4.4 本实验的不足之处
• 第三章 百合花发育相关基因的组织原位杂交研究
• 第一节 百合花发育 LLGLO1 基因的时空表达研究
• 1. 研究材料
• 2. 实验方法
• 2.1 材料处理
• 2.2 LLGLO1 特异探针制备
• 2.3 原位杂交
• 3. 实验结果与分析
• 3.1 LLGLO1 探针制备
• 3.2 LLGLO1 基因在麝香百合花器官中的表达
• 4. 讨论
• 第二节 百合花发育LLTCP1 基因的时空表达研究
• 1. 研究材料
• 2. 实验方法
• 2.1 LLTCP1 探针的制备
• 2.2 原位杂交
• 3. 实验结果与分析
• 3.1 LLTCP1 探针制备
• 3.2 LLTCP1 基因在麝香百合花器官中的表达
• 4. 讨论
• 总结和展望
• 参考文献
• 附录：试剂配制
• 详细摘要