蓝耳病病毒三种不同检测方法的建立

论文摘要

蓝耳病病毒可以引起母猪流产、早产、死胎、木乃伊胎及仔猪体质弱等病征,造成重大的经济损失。近年来在我国出现了一种新的高致病性病毒,为了检测这种新病毒需要建立一系列可以满足不同试验条件的检测方法。为此我们建立了RT-PCR、RT-LAMP和Real-Time荧光PCR这三种常规的检测方法。本研究选择高致病性蓝耳病病毒为研究对象,从NCBI上查阅多对高致病性蓝耳病病毒和正常病性蓝耳病病毒序列,分析高致病性蓝耳病和正常的蓝耳病病毒基因的结构特点,选择Nsp2基因和ORF7基因作为主要的研究对象,设计出多对引物及探针,用于RT-PCR、RT-LAMP和Real-Time荧光RT-PCR的方法进行检测分析。将蓝耳病病毒接种于Marc-145细胞进行培养,观测细胞病变征状。将病变细胞反复冻融3次后进行病毒传代培养。然后取传代多次后的病毒培养液分别进行RT-PCR、RT-LAMP和Real-Time荧光PCR试验。经过试验发现高致病性蓝耳病与传统蓝耳病病毒相比在Nsp2有连续87bp的缺少,而ORF7则较为保守,建立了3种可满足不同检测条件的方法,方便了蓝耳病的检测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 研究内容
• 试验一 蓝耳病病毒 RT-PCR 检测方法的建立
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 毒株和细胞
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 引物的设计与合成
• 1.1.4 病毒传代培养
• 1.1.5 RNA 抽提及cDNA 模板制备
• 1.1.6 PCR 方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 高致病性蓝耳病侵染结果
• 1.2.2 RT-PCR 对高致病性病毒株的检测
• 1.2.3 RT-PCR 对高致病性病毒株与低致病性病毒株的检测
• 1.3 小结
• 试验二 蓝耳病病毒RT-LAMP 检测方法的建立
• 2.1 材料及方法
• 2.1.1 病毒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 RT-LAMP 引物的设计及合成
• 2.1.5 病毒RNA 提取
• 2.1.6 PRRSV RNA 的反转录
• 2.1.7 RT-LAMP 反应体系、反应条件的优化立
• 2.1.8 RT-LAMP 的特异性试验
• 2.1.9 RT-LAMP 的敏感性试验
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 PRRSV RT-LAMP 反应体系、反应条件的优化
• 2.2.2 PRRSV RT-LAMP 结果判定
• 2.2.3 特异性试验
• 2.2.4 敏感性试验
• 2.3 小结
• 试验三 蓝耳病 Taqman real-time RT-PCR 方法的建立
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 病毒和细胞
• 3.1.2 质粒与菌株
• 3.1.3 其它试剂与仪器
• 3.1.4 引物与探针
• 3.1.5 反应体系及条件
• 3.1.6 不同探针浓度对Taqman real-time RT-PCR 的影响
• 3.1.7 不同的退火温度对 TaqMan 实时 RT-PCR 的影响
• 3.1.8 PRRSV 的特异性检测
• 3.1.9 PRRSV 的灵敏度检测
• 3.2 结果
• 3.2.1 检测不同的引物和退火温度对 Ct 值的影响
• 3.2.2 Taqman real-time RT-PCR 法的特异性和灵敏性分析
• 3.2.3 对送测样本的检测
• 3.3 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介