流式细胞术测定汉滩病毒滴度方法的建立

论文摘要

汉滩病毒（Hantaan virus, HTNV）归属于布尼亚病毒科（family Bunyaviridae）汉坦病毒属（genus Hantavirus）。汉坦病毒（Hantavirus）由病毒核心和囊膜组成,其基因组位于核心部分,为单股分节段的负链RNA,由大（L）中（M）小（S）3个基因片段组成,分别编码RNA聚合酶、囊膜糖蛋白（glycoprotein, GP）G1和G2,以及核衣壳蛋白（nucleocapsid protein, NP）。其中GP位于病毒外膜,在病毒与靶细胞的结合过程中发挥作用,GP上有中和抗原位点和型特异性抗原位点。NP与病毒基因组共同参与构成病毒核心,在病毒的组装过程中发挥作用,NP上没有中和位点,但存在组特异性抗原位点,能够诱发机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫应答。汉坦病毒的储存宿主为啮齿类动物,其感染后可以引起宿主动物持久的感染而不发病。汉坦病毒经气溶胶、密切接触等传播方式感染人体后,可引起两种急性传染病:多发于欧亚大陆的肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）和多发于南北美洲的汉坦病毒肺综合征/汉坦病毒心肺综合征（hantavirus pulmonary syndrome, HPS/hantavirus cardiopulmonarysyndrome, HCPS）。根据病毒抗原反应性和基因结构的不同,目前国内共发现7种不同的汉坦病毒血清型/基因型,其中只有黑线姬鼠携带的HTNV以及褐家鼠携带的汉城病毒（Seoul virus,SEOV）可引起HFRS。每年全球有60 000～100 000例HFRS报告病例,中国是全球HFRS疫情最为严重的国家,在1950～2007年之间,我国共报告1 557 622例HFRS患者,死亡46 427例,病死率达3%,成为严重危害人民群众健康的公共卫生问题。HTNV实验室培养最常用的细胞为Vero和Vero-E6细胞,均为克隆化的非洲绿猴肾细胞（African green monkey kidney cells）。HTNV在培养的细胞中生长较为缓慢,病毒滴度一般在接种病毒后的7～14 d达到高峰,此外,HTNV对细胞的致病变作用（cytopathic effect, CPE）较弱,一般不引起细胞皱缩、变圆、聚集、出现空泡、崩解和脱落等现象。另一种培养或扩增方法是将HTNV接种到乳鼠脑内,可获取较高滴度的病毒。病毒滴度测定是病毒学研究中需要解决的一个基本问题,最常用的表示病毒滴度的单位有空斑形成单位（plaque forming unit, PFU）和半数组织感染量(50% tissue culture infective dose, TCID50)。空斑实验是测定病毒滴度的经典方法,观察对象为病毒感染单层细胞后形成的空斑。主要操作过程为:将未知滴度的病毒悬液10倍稀释后接种到单层生长细胞中,病毒吸附完成后,在其上覆盖一层融化的琼脂糖或甲基纤维素营养液,凝固后孵育培养。当病毒在细胞内复制增殖,每一个具有感染性的病毒粒子会在覆盖物下的单层细胞中产生局限性的圆形感染细胞病灶,此时用中性红或结晶紫等染料染色,会在红色或紫色背景中显现出清晰的、未着色的“空斑”。由于每个空斑是由单个病毒粒子复制增殖形成,所以病毒原液的滴度可以用PFU/mL表示,即每mL病毒液所形成的空斑数。然而,空斑形成一般需要较长时间,并且对敏感细胞、实验条件和操作技术要求较高,许多因素如单层细胞的质量、操作过程和染色方法等均可影响实验结果,因此该方法的稳定性欠佳,所获得的结果很少能在其他实验室重复,即便是在同一实验室,由不同人员操作也很难获得一致的结果。TCID50法是用统计学方法来推算病毒的感染力,尤其适用于不能产生空斑的病毒。其方法是将病毒原液进行系列稀释,而后用病毒稀释液接种培养的细胞,经过一段时间孵育,观察各个稀释度的病毒引起细胞发生病变的情况,或用间接方法检测细胞受感染的情况,再用统计学方法（如Reed-Muench或Spearman-Karber法）计算出50%细胞孔发生感染的最小病毒量,即为TCID50。与空斑实验相比,该方法具有耗费时间较短、结果可以预测、不同操作者之间所得结果也比较接近等优点。其缺点主要为结果不够直观,所得结果不像空斑那样直接代表病毒感染力/毒力的大小,无法对病毒进行克隆纯化等。流式细胞术（flow cytometry, FCM）是一种快速检测分析单个粒子多个物理特性的高技术手段,其可以高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中获取多个参数,如细胞的大小、内部结构、以及平均荧光强度（mean fluorescent intensity, MFI）等,已成为目前较先进的细胞定量分析技术。应用FCM检测病毒抗原,统计阳性细胞的百分率,亦可以确定病毒滴度,该方法已广泛应用于人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus type 1, HIV-1）、单纯疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）、登革病毒（dengue virus, DENV）、流感病毒（influenza virus, IV）、狂犬病毒（rabies virus, RV）、轮状病毒（rotavirus）、痘苗病毒（vaccinia virus, VACV）、腺病毒（adenovirus, AV）、杆状病毒（baculovirus, BV）等多种病毒滴度的测定,然而目前尚未见用于测定汉坦病毒滴度的报道。本实验运用FCM对HTNV 76-118株感染的Vero-E6细胞进行病毒滴度测定,并与间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay, IFA）对比,以期建立一种能够快速测定HTNV滴度的方法。本课题研究内容和结果如下:1. HTNV的培养常规培养Vero-E6细胞,用本实验室既往保存的HTNV 76-118株感染Vero-E6细胞,通过Vero-E6细胞的连续传代使HTNV扩增,8～10 d后将Vero-E6细胞反复冻融3次后离心,取上清分装-80℃冻存。2. HTNV的空斑实验将收获的HTNV进行10倍稀释后接种于6孔板内单层贴壁生长的Vero-E6细胞,病毒吸附完成后,加入甲基纤维素覆盖液,37℃5% CO2培养箱孵育10 d,经甲醛固定、结晶紫染色,可获得清晰的病毒空斑。3. IFA检测HTNV滴度将收获的HTNV悬液进行10倍系列稀释后感染Vero-E6细胞,37℃5% CO2培养箱孵育12 h、24 h、36 h、48 h和72 h后进行IFA,统计阳性孔数量,依据Reed-Muench公式计算HTNV原液滴度。发现感染后36 h为测定病毒滴度的最佳时间,HTNV 76-118株的滴度为1.12×106TCID50/mL。4. FCM检测HTNV滴度HTNV 76-118株感染Vero-E6细胞,37℃5% CO2培养箱孵育12 h、24 h、36 h、48 h和72 h后收获细胞,以小鼠源性抗HTNV核蛋白单克隆抗体3G1为一抗,异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）标记的羊抗小鼠抗体为二抗,FCM检测阳性细胞率,评价感染后不同时间及不同病毒接种量的阳性细胞率。发现感染后36 h阳性细胞百分率为（10.06±0.42）%,感染后36 h可以作为对病毒滴度检测的最佳时间点,该结果与上述IFA检测结果一致。FCM测定的病毒滴度为1.9×106 IU/mL,FCM能检测到的最低滴度约为47.5 IU/mL。结论:相对于传统的空斑实验及TCID50检测,FCM是一种简单、敏感、快速检测HTNV滴度的方法。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 一、汉坦病毒的病原学和我国HFRS流行病学现状
• 二、汉坦病毒结构蛋白的研究进展
• 三、病毒滴度测定的常规方法
• 四、流式细胞术在病毒学中的应用
• 实验一 HTNV 对Vero-E6 细胞的感染及滴度测定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 流式细胞术对HTNV 滴度的检测
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢