论文摘要
第一部分类风湿关节炎患者外周血单核细胞向破骨样细胞转分化培养体系的建立目的:建立类风湿关节炎患者外周血单核细胞向破骨样细胞转分化的培养体系,并对所培养的破骨样细胞进行鉴定。方法:抽取类风湿关节炎患者外周静脉血,用密度梯度离心法获得单核细胞,分别接种于玻片和骨磨片。随机分为单核细胞集落刺激因子（macrophage-colony stimulating factor,M-CSF）组（A组）,加入25μg/LM-CSF:协同作用组（B组）,分别加入不同浓度的核因子κB受体活化子配体（Receptor activator of NF-κB ligand,RANKL,5、10、20、25、50μg/L）和25μg/L M-CSF。培养至4、12和20d时,取玻片行HE染色和抗酒石酸磷酸酶染色计数破骨样细胞,取骨磨片行甲苯胺兰染色检测破骨样细胞骨吸收活性。结果:1.对破骨样细胞转分化的影响:各组细胞分别于4,12,20天染色,显示RANKL呈浓度及时间依赖性诱导破骨样细胞形成（P＜0.05）。2.对破骨样细胞骨吸收活性的影响:RANKL和M-CSF协同诱导骨磨片上吸收陷窝的形成,RANKL呈浓度及时间依赖性增强破骨样细胞的吸收活性（P＜0.05）;单独M-CSF刺激不能形成骨吸收陷窝。结论:RANKL和M-CSF可协同诱导类风湿关节炎外周血单核细胞转分化为破骨样细胞,该培养方法稳定,有效,具有可重复性。第二部分锝[99Tc]亚甲基二膦酸盐对单核细胞向破骨样细胞转分化的影响及其机制研究目的:研究锝[99Tc]亚甲基二膦酸盐(Technetium[99Tc]methylenediphosphonate,99Tc-MDP)对类风湿关节炎患者外周血单核细胞向破骨样细胞转分化的影响,并探讨其与RANKL/RANK信号通路的关系。方法:抽取类风湿关节炎患者外周静脉血,用密度梯度离心法获得单核细胞,分别接种于玻片和骨磨片,予RANKL（25μg/L）和M-CSF（25μg/L）协同刺激,同时根据不同浓度99Tc—MDP（0、5、10、20mg/L）干预,随机分为4组。培养至4、12和20d时,取玻片行HE染色和抗酒石酸磷酸酶染色计数破骨样细胞,取骨磨片行甲苯胺兰染色检测破骨样细胞骨吸收活性。同时将单核细胞接种于培养板,分别于第4、8、12、16、20d加入20mg/L99Tc-MDP,24h后取细胞行半定量RT-PCR检测TRAF-6、MITF、PU.1、NFATc1 mRNA表达变化。结果:1.对破骨样细胞转分化的影响:各组细胞分别于4,12,20d染色,显示99Tc-MDP可呈浓度及时间依赖性抑制抗酒石酸磷酸酶染色阳性破骨样细胞形成（P＜0.05）。2.对破骨样细胞骨吸收活性的影响:99Tc-MDP可抑制骨磨片上吸收陷窝的数量,其抑制作用呈浓度及时间依赖性增强（P＜0.05）。3.对诱导条件下破骨样细胞内RANKL/RANK信号传导通路的影响:99Tc-MDP可抑制胞内MITF、NFATc1mRNA表达（P＜0.05）,12,16,20d较4d明显下降（P＜0.05）。对TRAF-6、PU.1 mRNA表达无影响（P＞0.05）。结论:99Tc-MDP可通过抑制类风湿关节炎患者外周血单核细胞向破骨样细胞转分化及其骨吸收活性,保护骨质,该机制可能与其对RANKL/RANK信号传导通路中MITF、NFATc1表达抑制有关。
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