论文摘要
目的:肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS）是一种进行性的神经系统退行性变性疾病,累及大脑皮层运动神经元、脊髓前角细胞及脑干运动神经核。主要特征为选择性上、下运动神经元丢失,出现进行性加重的肌肉萎缩、肌无力及锥体束征。其感觉系统一般不受侵犯。病人多在发病3-5年后由于延髓麻痹、呼吸肌麻痹或肺部感染而死亡。目前尚无有效治疗方法。Riluzole是目前唯一被批准用于ALS治疗的药物,但它仅可以延缓ALS的进展,不能改善症状或逆转进行性恶化的趋势。虽然ALS发病机制目前还不清楚,但普遍认为与遗传环境因素、氧化应激、线粒体的功能失常、兴奋性氨基酸的毒性作用、钙稳态的失衡、蛋白质的异常聚集等有关。10%的病人为家族性ALS（fALS）,90%为散发性ALS（sALS）。fALS和sALS的临床表现非常相似,约20%的fALS和4%的sALS患者携带有铜/锌超氧化物歧化酶（SOD1）的基因突变,其中以G93A突变位点最多,而转入人突变的SOD1 G93A的小鼠,因有与人类似的临床发病特点而成为世界上公认的研究ALS的动物模型。铁是体内最丰富的微量元素,由于其独特化学反应活性,在维持细胞和机体正常代谢过程中起着至关重要的作用,如:氧的输送、线粒体的氧化反应、神经递质和DNA合成等。然而,游离的二价铁离子能通过Fenton反应生成具有高度反应性的羟自由基,导致氧化应激,从而损害机体的一些基本成分,如脂质、蛋白、DNA等,导致细胞损伤。所以维持机体内铁的平衡对于机体是非常重要的。细胞内存在着精细的调节铁的机制,其中铁蛋白（Ferritin）是铁代谢的关键蛋白,可以结合游离的二价铁离子,防止Fenton反应,限制铁催化的羟自由基的生成及后续的氧化应激反应,从而防止细胞损伤的发生。Ferritin的改变在一定程度上代表了铁代谢的紊乱。Ferritin又是Nrf2/ARE信号通路下游的一种抗氧化蛋白,可以被诱导而发挥抗氧化应激的作用。Ferritin由H链和L链组成,H链有亚铁氧化酶作用,它催化可溶的二价铁离子氧化为不溶的三价铁离子,在铁的迅速解毒和细胞内铁的运输中起主要作用。Ferritin受细胞内铁浓度的调节,铁水平低时,Ferritin表达减少;铁增多时,Ferritin表达增加。文献报道在ALS病人大脑某些区域及脊髓前角运动神经元的胞核和胞浆中检测到铁离子水平增加。Mary K用基因芯片的方法发现在SOD1 G93A小鼠四月龄时脊髓中Ferritin L链和H链的mRNA升高。Strey CW等用双向凝胶电泳和质谱分析发现SOD1 G93A小鼠晚期与对照组小鼠相比,脊髓匀浆中Ferritin H链表达增加,说明铁稳态的改变在ALS发病中发挥了重要的作用。Annie S. Wu等发现给SOD1 G93A小鼠腹膜内注射铁卟啉,不论是早期给药还是症状出现时再给药（与病人开始治疗的时间类似）都能明显改善SOD1 G93A小鼠的运动功能、延长其存活期。本实验用世界上公认的ALS动物模型SOD1 G93A小鼠作为研究对象,研究不同时期小鼠骨骼肌中Ferritin H链的变化,寻求ALS的标记蛋白,探讨铁代谢在ALS发病中的作用,为临床早期诊断、治疗提供实验室依据。方法:1、转基因鼠的繁殖所有动物均饲养在恒温（25-27℃）、恒湿和无特定病原菌（Specific pathogen free, SPF）环境中,喂以灭菌的SPF级颗粒型鼠类饲料。为维持B6SJL-TgN （SOD1 G93A）1 Gur转基因小鼠突变基因稳定下传,将B6SJL SOD1 G93A/+半合子雄鼠与B6SJLF1/J雌鼠交配繁殖。子代鼠经基因鉴定确定是否带有人突变的基因。2、实验分组依据SOD1 G93A小鼠的发病规律分为80天（症状前期）、120天（症状早期）和终末期3个时间点取材。终末期以SOD1 G93A小鼠仰卧20秒不能翻身为准。每个时间点又设有模型组、对照组1和对照组2。模型组为SOD1 G93A小鼠,对照组1为Wild-type小鼠,对照组2为hSOD1转基因小鼠。每组每个时间点3只小鼠。3、观察变化及取材实验期间每天观察动物,每周称体重一次。在SOD1 G93A小鼠生长80天、120天和终末期时新鲜取材,Wild-type小鼠和hSOD1小鼠分别在相应时间点取材。用10%的水合氯醛0.1ml腹膜内注射麻醉后,取腓肠肌,放入1.5ml EP管,液氮冷冻,然后置-80℃保存。4、Ferritin H链的测定用western blotting的方法测定。首先提取肌肉组织中的蛋白,测定蛋白的浓度,计算出100μg所需要蛋白的μl数,然后进行SDS-PAGE电泳,100V恒压转膜2小时,5%脱脂奶粉封闭1小时,加入一抗4℃过夜,二抗避光孵育2小时,Odyssey Infrared Imaging System检测,并计算出目的条带与β-actin的比值,实验数据以均值+标准差（（x|-）±s）表示,采用SAS软件进行统计分析,组间比较采用Q检验,统计结果以P<0.05为有显著性差异。结果:1、子代鼠的鉴定:子代鼠基因组DNA的PCR产物电泳显示:位于300-400bp之间有一条带（324 bp）,为内参照IL-2的PCR产物;位于200-300bp之间的条带（236bp）,为突变SOD1基因的PCR产物。2、临床变化:在80天及以前SOD1 G93A小鼠与对照组小鼠一样,无明显临床变化,在110天左右SOD1 G93A小鼠开始出现肢体震颤、无力,120天左右出现步态明显异常、迈步的距离变短;随后渐出现一侧后肢行走时的拖拽现象和肌肉萎缩,整个后肢和后半身逐渐萎缩消瘦,不能支撑身体,双侧后肢呈伸直样,约在140-150天左右,小鼠四肢均受累,将其仰卧后20秒内小鼠不能自行翻转,达终末期。Wild-type小鼠和hSOD1小鼠无上述表现、非常活跃,与其他正常小鼠并无差别。3、Ferritin H链的蛋白水平:与Wild-type小鼠和hSOD1小鼠相比,SOD1 G93A小鼠骨骼肌中Ferritin H链的表达在80天时没有显著变化（P>0.05）,而在120天和终末期时,SOD1 G93A小鼠骨骼肌中Ferritin H链的表达明显增加（P<0.05）,Wild-type小鼠与hSOD1小鼠相比无显著性差别（P>0.05）。结论:SOD1 G93A小鼠是研究肌萎缩侧索硬化的理想的动物模型,与Wild-type小鼠和hSOD1小鼠相比,在120天和终末期时,SOD1 G93A小鼠骨骼肌中的Ferritin H链表达增多,推测Ferritin H链表达上调是机体对铁过载的保护性反应,或是Nrf2/ARE信号通路激活的结果。