基于PCR-DGGE方法的餐厨垃圾堆肥微生物多样性分析

论文摘要

堆肥化是依靠自然界广泛分布的细菌、真菌、放线菌等微生物,是自然界微生物降解过程的强化,微生物是堆肥处理系统中的主有功能生物,充分了解其中的微生物学原理能为改进堆肥处理工艺、提高堆肥处理效率提供理论依据。但基于培养和分离纯化的环境微生物群落研究方法已经无法满足研究者对环境微生物进行快速、准确的分析与鉴定的要求。利用分子生物学技术PCR-DGGE,研究者可以在不对微生物进行分离培养的情况下对其进行研究,并进行微生物群落的结构和功能进行分析,结果快速、准确。本论文使用基于16S rDNA的PCR-DGGE（变性梯度凝胶电泳）技术对城市餐厨垃圾堆肥过程中细菌种群结构随时间的变化进行了研究。在堆肥不同时间取样,进行了堆肥物理化学参数的变化分析和DGGE分析,结果显示,堆肥最终pH值接近7.5;C/N为20.04;堆肥温度高于50℃天数为7d,最高达64℃,可有效杀灭致病菌;PCR-DGGE图谱显示,不同时间堆肥样中细菌DGGE图谱有着明显的差异性,堆肥升温期细菌种群丰富,优势种群不明显;高温期细菌种群减少,优势种群明显;降温期细菌种群结构基本保持稳定。温度对堆肥过程中细菌种群具有明显的筛选作用。堆肥各阶段DGGE图谱相似性Cs值比较低,堆肥处理后细菌种群结构与堆肥原料之间存在明显差异。使用PCR-DGGE和系统发育分析对餐厨垃圾高温堆肥中嗜热细菌种群结构进行了研究。研究对象为堆肥高温阶段（>50℃）的7d,从这7d的堆肥样中提取微生物总DNA,使用细菌通用引物对（GC-341F/907R）从总DNA中成功PCR扩增出目标16S rDNA片段,对扩增16S rDNA进行DGGE分析,DGGE条带相似性Cs值分析和切胶测序,使用序列数据进行同源性分析并建立了系统发育树。结果表明,堆肥高温阶段有着比较丰富的细菌多样性,同时存在明显的优势种群结构变化,切胶测序和系统发育分析结果表明,大部分高温阶段优势种群序列与芽孢杆菌属（Bacillus）和梭菌属（Clostridium）中的嗜热菌群具有较近的亲缘关系。研究了餐厨垃圾堆肥高温阶段中真菌和放线菌种群结构,通过微生物总DNA的提取和使用真菌特异性引物对（ GC-NS7/NS8 ）、放线菌特异性引物对（GC-R513/F243）扩增目标片段,对PCR产物进行DGGE分析和相似性Cs值分析,结果表明:高温阶段餐厨垃圾堆体中真菌、放线菌优势种群明显。高温期真菌经历比较明显的三个阶段,高温期堆体中放线菌生长与真菌生长规律类似。餐厨垃圾堆肥高温期真菌、放线菌DGGE图谱相似性Cs值不高,堆体中真菌、放线菌群落经历了明显的演变过程,群落结构和优势种群具有时序动态性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 餐厨垃圾特征及其危害
• 1.1.1 餐厨垃圾的特征
• 1.1.2 餐厨垃圾的危害
• 1.2 堆肥
• 1.2.1 堆肥原理
• 1.2.2 堆肥影响因素
• 1.2.3 堆肥评价指标
• 1.2.4 堆肥微生物及优势种群
• 1.2.4.1 细菌
• 1.2.4.2 放线菌
• 1.2.4.3 真菌
• 1.3 微生物多样性研究
• 1.3.1 微生物物种的多样性
• 1.3.2 微生物多样性的某些特征
• 1.3.3 微生物多样性研究方法
• 1.4 分子生物学方法在堆肥微生物多样性研究中的应用
• 1.4.1 研究样品的制备
• 1.4.2 堆肥微生物特征核酸的获取与分析
• 1.4.3 聚合酶链式反应（PCR）扩增
• 1.4.3.1 PCR 扩增反应条件
• 1.4.3.2 PCR 扩增反应条件及一般程序
• 1.4.4 基于PCR 的核酸技术
• 1.4.4.1 PCR-SSCP
• 1.4.4.2 PCR-RFLP/TRFLP
• 1.4.4.3 PCR-RAPD/ARAPD
• 1.4.4.4 PCR-DGGE 方法
• 1.4.4.5 定量PCR 技术
• 1.4.5 基于PCR 的测序技术
• 1.4.6 荧光原位杂交（FISH）
• 1.5 变性梯度凝胶电泳技术简介
• 1.5.1 DGGE 的基本原理
• 1.5.2 DGGE 在微生物生态学研究中的应用
• 1.5.3 DGGE 技术自身存在的缺陷
• 1.5.3.1 DGGE 技术所存在的缺陷
• 1.5.3.2 减少实验偏差的解决办法
• 1.5.4 DGGE 在微生物生态学中的应用前景
• 1.6 主要分子生物学方法的比较
• 1.7 利用分子生物学方法进行微生物群落分析的展望
• 1.8 本研究的立题背景及研究意义
• 第2章 PCR-DGGE 技术分析餐厨垃圾堆肥中细菌种群结构
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 实验设备
• 2.1.1.2 堆肥
• 2.1.1.3 样品的初处理
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 参数测定
• 2.1.2.2 总DNA 的提取
• 2.1.2.3 DNA 的纯化
• 2.1.2.4 PCR 扩增
• 2.1.2.5 DGGE 分析
• 2.1.2.6 DGGE 图谱相似性（Cs）分析
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 堆肥化过程中的参数变化
• 2.2.2 堆肥样品基因组总DNA 的提取与PCR 扩增
• 2.2.3 PCR 扩增
• 2.2.4 堆肥周期细菌种群DGGE 指纹图谱结果与Cs 值分析
• 2.3 结论
• 第3章 餐厨垃圾堆肥高温阶段细菌种群结构及系统发育分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 样品来源
• 3.1.1.2 样品的初处理
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 总DNA 的提取与纯化
• 3.1.2.2 PCR 扩增
• 3.1.2.3 高温阶段嗜热细菌种群动态的DGGE 分析
• 3.1.2.4 高温阶段DGGE 图谱相似性（Cs）分析
• 3.1.2.5 优势条带测序分析
• 3.1.2.6 系统发育分析
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 餐厨垃圾堆肥化
• 3.2.2 高温阶段堆肥样总DNA 的提取、纯化与 PCR 扩增
• 3.2.3 高温阶段堆肥样品DGGE 指纹图谱结果与Cs 值分析
• 3.2.4 嗜热细菌系统发育分析
• 3.3 结论
• 第4章 PCR-DGGE 技术分析餐厨垃圾堆肥高温阶段真菌、放线菌种群结构
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 样品来源
• 4.1.1.2 样品的初处理
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.2.1 总DNA 的提取与纯化
• 4.1.2.2 真菌、放线菌特异性引物PCR 扩增
• 4.1.2.3 真菌、放线菌种群动态的DGGE 分析
• 4.1.2.4 真菌、放线菌DGGE 图谱相似性（Cs）分析
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 堆肥样总DNA 的提取、纯化
• 4.2.2 真菌、放线菌特异性引物PCR 扩增
• 4.2.3 堆肥样真菌、放线菌DGGE 图谱结果与Cs 值分析
• 4.3 结论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录 A 攻读学位期间发表论文