观赏向日葵花色形成的机理研究

论文摘要

观赏向日葵（Helianthus annuus）在欧美等国市场由来已久,既可作切花,也是用于园林布置。近年来观赏向日葵作为国内新兴的观赏植物,逐渐受到我国消费者的喜爱。类黄酮化合物是植物次生代谢产物的一部分,大部分花色都是由这类化合物的生成而产生的。花色素苷是类黄酮类化合物中最重要的一类化合物。目前人们对花色素苷的生物合成途径已有详细的研究,该途径中几乎所有的基因包括一些调节基因均已分离。但有关观赏向日葵花色形成的机理研究尚未见报道。因此开展观赏向日葵花瓣色素成分分析以及花色素苷生物合成相关基因的克隆与表达对于阐明观赏向日葵花色形成的机理、利用基因工程培育新品种等具有广泛的应用前景。本论文主要研究内容包括:（1）以不同花色品种的观赏向日葵为材料,分析不同播期下观赏向日葵的生长发育特性及其适应性;（2）通过特征颜色反应、紫外一可见光谱等多种植物成分分析方法检测观赏向日葵花瓣色素中的各主要成分以及观赏向日葵花色素苷在不同光温条件下的稳定性:（3）根据已克隆的花色素苷生物合成相关基因的保守区域设计引物,利用RT-PCR克隆观赏向日葵花色素苷生物合成途径中的结构基因,并利用半定量RT-PCR检测花色素苷合成相关基因在不同器官、不同花发育时期和不同颜色花瓣中的转录表达情况;（4）利用电子延伸技术分离观赏向日葵osDFR基因的编码区序列,并对所获得的osDFR基因进行Southern杂交分析、原核表达分析,以及利用PCR技术对osDFR基因的底物结合位点进行定点突变。主要研究结果如下:（1）筛选6个具有典型花色的观赏向日葵品种为试验材料,于春、夏、秋、冬等4个播期下研究观赏向日葵的生长发育特性。不同播期观赏向日葵的不同生育阶段和生物学性状间的相关系数有较大的显著性差异;不同生育期和生物学性状组合间的典范相关分析表明春播植株主要表现在主要集中于全生育期与单株成花分枝数、花期与单株花数的相互关系上,夏播植株主要表现在营养生长期与单株分枝数、籽粒成熟期与单株花数的相互关系上,秋播植株主要表现在全生育期与成花分枝数和茎粗的相互关系上,冬播植株主要表现在全生育期和花期与单株花数,籽粒成熟期与成花分枝数的相互关系上。由3-6月播期下的观赏向日葵株高的生长散点图以及拟合回归方程可知,Logistic模型较好地反映观赏向日葵株高的生长动态变化。3个花色品种株高生长存在一定的差异,‘Valentine’品种株高的极限生长量最大,‘Joker’品种的极限生长量最小。4月份播期的株高生长较为迅速,6月份播期株高生长量明显减缓,并且较早进入生长的缓慢停滞期。不同播期下观赏向日葵的株型亦存在较大的变异。（2）观赏向日葵花瓣色素的化学显色反应表明花瓣中主要是以类黄酮为母核的一类物质,以黄酮、黄酮醇、二氢黄酮醇为主,其中‘Joker’和’Ring of Fire’品种中还可能含有花色素苷。紫外-可见光光谱分析表明观赏向日葵4个品种的花瓣色素中均可能含有二氢黄酮醇类物质,而红色系列的‘Joker’和‘Ring of Fire’品种在530nm附近的可见光范围内还有最大吸收波长,其花瓣色素中可能含有花色素苷类物质。HPLC-MS技术检测表明观赏向日葵‘Ring of Fire’品种花瓣花色素中可能含有带有双糖（葡萄糖与阿拉伯糖）的天竺葵色素苷;‘Joker’品种中可能含有锦葵素-3-芸香糖苷和矢车菊素-3-葡糖苷;而‘Ikarus’和‘Valentine’品种中可能均含有红花苷;4个花色品种可能均含有二氢槲皮素-3-葡糖苷。对提取的花瓣色素进行了光温稳定性研究,发现避光条件下观赏向日葵花瓣花色素苷的稳定性要强于光照条件。观赏向日葵紫红色和红褐色花瓣花色素苷在温度变化过程中稳定性较差,具有一定的波动性;但在一定温度范围内,花色素苷含量并没有随着温度的提高而减少。（3）根据已发布的基因保守区域设计了特异引物或简并引物,从观赏向日葵紫红色品种‘Ring of Fire’花瓣中成功获得了PAL（Genbank登录号:EF566469）、CHS、CHI（Genbank登录号:EU366166）、F3’H（Genbank登录号:EU366167）、DFR（Genbank登录号:EF492066）和ANS（Genbank登录号:DQ884194）等花色素苷生物合成途径中6个结构基因的保守序列。序列分析表明6个结构基因与其它植物来源的花色素苷生物合成相关基因均具有较高的同源性。系统进化分析表明6个结构基因的系统进化基本上符合植物分类学分类;除CHI外的2个上游基因（PAL、CHS）的进化速率要低于3个下游基因（F3’H,DFR,ANS）。半定量RT-PCR分析结果除CHS基因在管状花花瓣中未表达外,其它5个基因在舌状花花瓣、管状花花瓣、花蕾、叶片、茎皮中均有表达,表明花色素苷合成相关基因的表达没有器官特异性。但花色素苷合成相关基因在花组织（舌状花、管状花、花蕾）中的表达量要高于其它器官,且以在花蕾中的表达量最高。观赏向日葵花色素苷合成相关基因的表达同花发育紧密相关,即大部分结构基因在花开放初期和盛期的表达较高;花完全开放后,所有基因的转录水平均降低。观赏向日葵花色素苷合成相关基因的表达与花瓣颜色的深浅存在一定的关系。CHI基因除在红褐色花瓣中具有较高的表达外,在其它颜色的花瓣中很低。F3’H基因在紫色系列（‘Ring of Fire’、‘Mouling Rouge’）的花瓣中的表达分别高于红色系列（‘Joker’、‘Autumn Beauty’）花瓣。DFR和ANS基因在深色花瓣中（‘MoulingRouge’和‘Autumn Beauty’）的表达均高于混杂色的花瓣（‘Ring of Fire’和‘Joker’）。（4）利用EST数据库以及已克隆的BFR基因保守序列,进行电子延伸后结合PCR技术成功克隆到观赏向日葵osDFR基因的编码区。osDFR基因推导氨基酸序列分析表明观赏向日葵osDFR基因5’端具有NADP结合位点,其134位氨基酸为天冬酰胺,因此观赏向日葵’Ring of Fire’品种中可能是以DHK为DFR酶的作用底物。系统进化分析表明DFR蛋白依据单子叶和双子叶植物划分为两类,与植物分类学分类基本一致。osDFR基因在观赏向日葵4个花色品种花瓣基因组中至少有1个以上的拷贝数。本研究利用PCR技术成功敲除osDFR底物结合区域,并将osDFR基因推导氨基酸134位的天冬酰胺分别突变为天门冬氨酸和亮氨酸,成功获得突变的基因KODFR、N134D和N134L,并将其插入到植物真核表达载体pCAMBIA1300,获得重组质粒pCAM-KODFR、pCAM-N134D和pCAM-N134L。

论文目录

摘要

Abstract

第一章文献综述

1 类黄酮化合物的研究进展

1.1 概况

1.2 类黄酮化合物的生物功能

1.3 类黄酮化合物的提取分离与结构分析

1.3.1 类黄酮化合物的理化性质

1.3.2 类黄酮化合物的检识

1.3.3 类黄酮化合物的提取与分离

1.3.4 类黄酮化合物的结构分析

1.4 类黄酮的生物合成途径

1.5 花色素苷生物合成相关酶及其基因

1.5.1 结构基因

1.5.2 调节基因

1.6 花色素苷合成相关基因的表达调控

2 观赏向日葵的研究现状

3 本研究的目的和意义

第二章观赏向日葵适应性研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 试验设计与性状调查

1.3 株高生长动态考察及生长函数设定

1.4 数据整理与统计分析

2 结果与分析

2.1 不同生长季节下观赏向日葵主要性状差异性分析

2.2 生育期间和生物学性状间的简单相关分析

2.3 不同播期生育期和生物学性状间的典范相关分析

2.4 不同播期对观赏向日葵株高生长的影响

2.5 不同播期对观赏向日葵株形的影响

3 小结与讨论

3.1 不同播期对观赏向日葵生育期与生物学性状差异性的影响

3.2 不同播期对观赏向日葵生育期与生物学性状相关性的影响

3.3 不同播期对观赏向日葵株高生长动态的影响

3.4 不同播期对观赏向日葵株型的影响

第三章观赏向日葵花瓣色素成分分析

1 材料与方法

1.1 花朵采集与处理

1.2 试剂

1.3 观赏向日葵花瓣色素的定性鉴定

1.3.1 色素提取与浓缩

1.3.2 特征颜色反应

1.3.3 薄层层析（TLC）分离纯化

1.3.4 紫外—可见光分光光度法检测花色素

1.3.5 花色素的HPLC-MS分析

1.3.6 花色素的MS分析

1.4 观赏向日葵花瓣花色素苷的稳定性

2 结果与分析

2.1 观赏向日葵花瓣色素的特征颜色反应

2.1.1 石油醚和氨水测试

2.1.2 浓盐酸—镁粉反应

2.1.3 硼氢化钠反应

2.1.4 三氯化铝的显色反应

2.1.5 三氯化铁的显色反应

2.1.6 醋酸铅显色反应

2.1.7 氯化锶显色反应

2.1.8 硼酸显色反应

2.1.9 碱性试剂的显色反应

2.2 紫外—可见光分光光度法检测花色素

2.3 花色素的HPLC分析

2.4 花色素MS分析

2.5 观赏向日葵花瓣花色素苷的稳定性研究

2.5.1 光对花色素苷含量的影响

2.5.2 温度对花色素苷含量的影响

3 小结与讨论

3.1 观赏向日葵花瓣色素的成分分析

3.2 观赏向日葵花瓣花色素苷的稳定性

第四章观赏向日葵花色素苷合成相关基因的克隆与表达

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

1.1.2 供试菌种及载体

1.1.3 引物设计

1.1.4 主要分子生物学及生化试剂

1.2 方法

1.2.1 RNA提取

1.2.2 cDNA第一链合成

1.2.3 观赏向日葵花色素苷合成相关基因PCR扩增

1.2.4 PCR产物目的片段回收

1.2.5 PCR产物目的片段克隆

1.2.6 PCR产物目的片段的序列测定

1.2.7 观赏向日葵花色素苷合成相关基因目的片段的序列分析

1.3 观赏向日葵花色素苷合成相关基因半定量RT-PCR

1.3.1 不同器官观赏向日葵花色素苷合成相关基因的表达

1.3.2 花发育过程中观赏向日葵花色素苷合成相关基因的表达

1.3.3 不同颜色花瓣观赏向日葵花色素苷合成相关基因的表达

2 结果与分析

2.1 观赏向日葵花瓣总RNA的提取

2.2 观赏向日葵花色素苷合成相关酶基因的克隆与序列分析

2.2.1 观赏向日葵PAL基因的克隆与序列分析

2.2.2 观赏向日葵CHS基因的克隆与序列分析

2.2.3 观赏向日葵CHI基因的克隆与序列分析

2.2.4 观赏向日葵F3'H基因的克隆与序列分析

2.2.5 观赏向日葵DFR基因的克隆与序列分析

2.2.6 观赏向日葵ANS基因的克隆与序列分析

2.2.7 观赏向日葵花色素苷生物合成相关基因的进化分析

2.3 不同器官观赏向日葵花色素苷的积累与合成相关基因的表达

2.3.1 总RNA的提取与电泳检测

2.3.2 不同器官观赏向日葵花色素苷生物合成相关基因的表达

2.3.3 花发育过程中观赏向日花色素苷生物合成相关基因的表达

2.3.4 观赏向日葵不同颜色花瓣中花色素苷生物合成相关基因的表达

3 小结与讨论

3.1 观赏向日葵花色素苷生物合成相关基因的克隆

3.2 观赏向曰葵花色素苷生物合成相关基因的表达

第五章基于EST的观赏向日葵osDFR基因编码区克隆及分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

1.1.2 供试菌种及载体

1.1.3 主要分子生物学及生化试剂

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

1.2.2 RNA提取与cDNA第一链合成

1.2.3 观赏向日葵osDFR基因编码区的电子延伸与克隆

1.2.4 osDFR基因在大肠杆菌中的表达

1.2.5 Southern杂交

1.2.6 反义真核表达载体pCAM1300-antiDFR构建

1.2.7 PCR介导的底物结合位点敲除与突变

2 结果与分析

2.1 观赏向日葵花瓣总RNA的提取

2.2 基于EST的osDFR基因编码区克隆与序列分析

2.2.1 观赏向日葵osDFR基因编码区的获得

2.2.2 观赏向日葵osDFR基因编码蛋白质产物的结构分析及功能预测

2.3 观赏向日葵osDFR基因的Southern杂交分析

2.4 观赏向日葵osDFR基因在大肠杆菌中的表达

2.4.1 原核表达载体ptT-28-DFR的构建

2.4.2 目的蛋白的诱导表达

2.5 反义真核表达载体pCAM1300-antiDFR构建

2.6 PCR介导的底物结合位点定点突变

2.6.1 目的片段KODFR的获得

2.6.2 目的片段N1340和N134L的获得

2.6.3 真核表达载体pCAM-KODFR、pCAM-N134D和pCAM-N134L构建

2.6.4 目的片段KODFR、5134D和N134L的测序

3 小结与讨论

第六章本研究的主要结论、创新点及今后研究方向

1 主要结论

2 创新点

3 今后研究方向

参考文献

附录1 观赏向日葵不同花色品种

附录2 缩略词

附录3 在学期间发表的文章

致谢

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