铁线蕨总DNA提取及其转基因研究

论文摘要

以铁线蕨为研究材料，首先对其总DNA提取方法进行改良，并证明了改良方法的优越性；其次分别建立了铁线蕨孢子体与配子体的再生体系，并通过农杆菌介导法与基因枪法对其进行了转基因实验，从而探讨此再生体系基础上进行的铁线蕨转基因实验的可行性。主要研究结果如下：1.蕨类植物因含有高酚、高糖等次生代谢物而使其总DNA的提取难度大于其它植物。以铁线蕨孢子体世代与配子体世代植株为材料，采用9种不同方法提取总DNA，并通过检测体系对所得总DNA进行分析。结果表明：结构简单的配子体为材料获得的铁线蕨总DNA的纯度明显高于孢子体，但是产量也明显低于孢子体；对于配子体而言，CTAB法、SDS法、高盐低pH法、尿素提取法、试剂盒法都能提取到较为纯净的总DNA，但经过DNA完整性检测体系筛选后，改良CTAB法结果最优；对于含大量次生代谢产物的孢子体植株而言，改良CTAB法得到的总DNA纯度明显高于其它，通过后续的DNA完整性检测得到与配子体相同结论。2.铁线蕨再生体系的建立。以铁线蕨孢子体植株拳卷叶或初伸展的羽叶为材料，光照条件选择12h光照/12h黑暗，首先在0.5mg/L6-BA＋0.5mg/L2,4-D（或1mg/L2,4-D）的MS培养基中初步诱导产生紧密型愈伤组织，后将其继续在同样培养基上继代培养，当继代3～4代后转移到0.5mg/L6-BA或1mg/L6-BA的MS培养基中诱导体细胞胚再生，之后转移至不含激素的MS培养基上诱导再生孢子体小苗，确定铁线蕨孢子体诱导愈伤组织的再分化体系。以铁线蕨孢子为材料，其萌发以红光诱导2d为最佳，在实验室条件下其生长周期主要划分为以下6个时期：孢子，孢子萌发，心形原叶体时期，精子器、颈卵器发育期，幼小孢子体植株，成熟孢子体植株产生孢子，确定为铁线蕨配子体再生体系。3.通过农杆菌介导法与基因枪法对铁线蕨进行转基因初探。研究结果表明：两种方法在对铁线蕨不同材料进行转基因实验后，已长出精子器和颈卵器的原叶体均表现出较高的敏感性，通过GFP检测得到最多的信号。通过农杆菌介导法转基因后的材料再生过程中由于受抗生素的影响，出现大批量死亡；通过基因枪法转基因后的材料再生过程中由于严重污染受胁迫而不能正常生长。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 铁线蕨研究进展
• 1.1.1 铁线蕨配子体相关研究
• 1.1.2 铁线蕨 cpDNA 分析
• 1.1.3 铁线蕨原叶体的 EST 分析
• 1.2 植物总 DNA 提取方法研究进展
• 1.2.1 植物总 DNA 提取常用方法
• 1.2.2 植物总 DNA 常用检测方法
• 1.3 蕨类植物组织培养研究进展
• 1.3.1 外植体、基本培养基的选择
• 1.3.2 不同激素与培养基 pH 值对蕨类植物脱分化、再分化的影响
• 1.4 植物转基因研究
• 1.4.1 农杆菌介导法
• 1.4.2 基因枪法
• 2 引言
• 3 不同方法提取铁线蕨基因组 DNA
• 3.1 实验仪器与材料方法
• 3.1.1 实验仪器
• 3.1.2 植物材料
• 3.1.3 试剂配方
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 铁线蕨总 DNA 不同提取方法
• 3.2.2 铁线蕨总 DNA 纯度及完整性检测
• 3.3 实验结果与分析
• 3.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.3.2 紫外分光光度计检测
• 3.3.3 铁线蕨 DNA 完整性检测
• 4 铁线蕨组织培养体系建立
• 4.1 铁线蕨孢子体叶片再生体系建立
• 4.1.1 实验仪器与材料试剂
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.3 实验结果与分析
• 4.2 铁线蕨孢子培养体系建立
• 4.2.1 实验仪器与材料试剂
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.3 实验结果与分析
• 5 铁线蕨转基因初探
• 5.1 pCAMBIA 1300:2×35 S Promotor: EGFP 质粒的构建
• 5.1.1 实验仪器与材料试剂
• 5.1.2 实验方法
• 5.1.3 实验结果与分析
• 5.2 铁线蕨农杆菌介导法转基因
• 5.2.1 实验仪器与材料试剂
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.3 实验结果与分析
• 5.3 铁线蕨基因枪法转基因
• 5.3.1 实验仪器与材料试剂
• 5.3.2 实验方法
• 5.3.3 实验结果与分析
• 6 结论与讨论
• 6.1 结论
• 6.2 讨论
• 参考文献
• Abstract