耐冷菌Bacillus cereus SYP A2-3产冷适蛋白酶的研究

论文摘要

冷适蛋白酶在低温下有较高的催化活性,在食品、化工、医药等领域具有潜在的应用价值,其研究已受到国内外的广泛重视。本文从中国冰川1号雪山微生物样本中筛选获得1株能够产冷适蛋白酶的耐冷菌Bacillus cereus SYP A2-3,并系统开展了发酵产酶、分离纯化和酶学性质等多项研究,为深入开发我国冷适微生物资源提供了素材,并在适冷机制的理论研究方面,提出了一些有价值的观点。SYP A2-3是一株革兰氏阳性芽孢杆菌,能在0-38℃范围内生长,最适生长温度在25℃,最大NaCl耐受浓度8%,能够利用多种碳源和氮源,VP反应、触酶实验、明胶液化实验、M-R实验呈阳性。实验测定了该株菌的16s rDNA,在系统发育树中,该菌与Bacillus cereus和Bacillus thuringiensis有较近的亲缘关系,结合表型分类和16s rDNA序列比对结果,将SYP A2-3鉴定为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）。产酶条件研究显示,SYP A2-3最适产酶温度15℃,培养基最适初始pH 6.5-7.0,可溶性淀粉、果糖和葡萄糖是较好的碳源,其适宜的浓度是10 g/L,高浓度的糖能够起到代谢阻遏作用。酪蛋白是较好的氮源,其适宜浓度是10-20 g/L。实验系统地对蛋白酶的底物诱导作用和降解产物的阻遏作用进行了研究。氨基酸残基链长35-55的肽类诱导产酶能力最强,而小分子氮源能够阻遏蛋白酶的形成,因而氮源对蛋白酶合成的诱导和阻遏的双重调节功能与肽链长度有关。对粗料氮源,通过预水解可以提高培养基中α-氨基氮水平,起到促进菌体前期生长作用,能够较大幅度提高其蛋白酶产量,如预水解后的豆粕产酶增加了1100 U/mL,这一机制可能应用于其它蛋白酶的生产调节。鉴于冷适微生物最适生长温度和产酶温度的差异,实验研究了变温培养方式。在近于最适温度下进行细胞培养可缩短培养时间,获得较高的菌体浓度。采用摇瓶方式,20℃预培养16 h比15℃恒温发酵产酶提高28.2%。综合应用变温培养、pH流加控制、氮源补加和产酶保护等控制策略,在5L小罐发酵产酶为4840 U/mL,其产酶高峰在45 h,提前了5-8 h。采用超滤和分级盐析操作能够有效去除杂蛋白,超滤浓缩实现75.3%的回收率,分级盐析酶活回收率达到56.0%。应用离子交换（DEAE fastflow）、凝胶层析（Superdex G75）实现了Bacillus cereus Neutral Protease （BcNP）的分离和纯化。严格的低温操作、快速的纯化方式和全程的酶蛋白保护措施是BcNP纯化技术的关键。BcNP分子量为34.2 kDa,pI为4.8-5.0。以酪蛋白为底物,其最适催化温度为42℃,最适pH范围为7.0-8.5。Ca2+、Mn2+对其有一定的激活作用,Cu2+、Pb2+、Co2+对活性有一定的抑制,该酶不受丝氨酸型蛋白酶抑制剂PMSF的抑制,但受EDTA强烈抑制,具有金属蛋白酶典型特性。BcNP冷适性表现在三点:一是最适催化温度在40℃左右,低于中温酶近10℃;二

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 冷适微生物的生态分布及主要研究领域
• 1.1.1 冷适微生物的概念和范畴
• 1.1.2 冷适微生物的生态分布及生态作用
• 1.1.3 冷适微生物的种类
• 1.1.4 冷适微生物的主要研究领域
• 1.2 冷适微生物的适冷机制
• 1.2.1 细胞壁组分
• 1.2.2 膜通透性及流动性
• 1.2.3 膜蛋白和脂多糖
• 1.2.4 tRNA 的转录后修饰
• 1.2.5 蛋白质合成
• 1.2.6 冷休克蛋白
• 1.2.7 冷适酶类
• 1.3 冷适酶高效催化机制及结构上的特性
• 1.3.1 冷适酶的催化特性
• 1.3.2 冷适酶结构上的柔韧性
• 1.3.3 冷适酶的序列特征
• 1.3.4 冷适酶的热不稳定性
• 1.3.5 冷适酶的冷适应机制
• 1.4 蛋白酶分类体系和作用特点
• 1.4.1 外肽酶和内肽酶
• 1.4.2 丝氨酸蛋白酶
• 1.4.3 天冬氨酸蛋白酶
• 1.4.4 半胱氨酸蛋白酶
• 1.4.5 金属蛋白酶
• 1.5 冷适蛋白酶研究现状、存在不足和应用前景
• 1.5.1 冷适蛋白酶的研究现状
• 1.5.2 冷适蛋白酶研究存在的不足
• 1.5.3 冷适蛋白酶的应用现状和前景
• 1.6 本论文的研究目的及意义
• 第二章 产冷适蛋白酶耐冷菌的筛选及鉴定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 样品来源
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要仪器及设备
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 蛋白酶酶活测定
• 2.1.6 产蛋白酶菌株筛选
• 2.1.7 菌体光密度测定
• 2.1.8 菌株生长特性及生理生化试验
• 2.1.9 16s rDNA 序列测定
• 2.1.10 菌株鉴定及系统发育树构建
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 产酶菌株的初筛和分离
• 2.2.2 菌株形态观察及染色实验
• 2.2.3 摇瓶复筛和粗酶催化特性
• 2.2.4 SYP A2-3 电镜观察
• 2.2.5 SYP A2-3 生理生化特征
• 2.2.6 菌株鉴定
• 2.2.7 16s rDNA 比对及系统发育树构建
• 2.3 讨论
• 2.3.1 关于蜡状芽孢杆菌与苏云金杆菌的鉴别
• 2.3.2 蜡状芽孢杆菌冷适性研究情况
• 2.3.3 蜡状芽孢杆菌蛋白酶研究概况
• 2.4 本章主要结论
• 第三章 Bacillus cereus SYP A2-3 产冷适蛋白酶的条件研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 培养基
• 3.1.2 基本培养方法
• 3.1.3 发酵产酶研究
• 3.1.4 菌体生物量及菌体得率
• 3.1.5 发酵液酶谱电泳
• 3.1.6 变温培养
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 摇瓶种子生长曲线和接种时间
• 3.2.2 接种量对菌体生长和产酶影响
• 3.2.3 温度对发酵产酶的影响
• 3.2.4 发酵产酶对溶氧的需求
• 3.2.5 培养基pH 对发酵产酶的影响
• 3.2.6 碳源对发酵产酶的影响
• 3.2.7 氮源对发酵产酶的影响
• 3.2.8 产酶过程中酶的保护
• 3.3 讨论
• 3.3.1 培养温度的选择
• 3.3.2 温度对产酶行为的调控
• 3.3.3 碳源阻遏现象和对糖利用特点
• 3.3.4 氮源聚合度对产酶的影响
• 3.3.5 酶的稳定性和保护
• 3.4 本章主要结论
• 第四章 氮源对Bacillus cereus SYP A2-3 产冷适蛋白酶的影响及其调控的初步研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料和仪器
• 4.1.2 不同水解度酪蛋白的制备
• 4.1.3 酪蛋白肽的分离
• 4.1.4 分子量分布测定
• 4.1.5 诱导产酶实验
• 4.1.6 氮源补加实验
• 4.1.7 产酶速率测定
• 4.1.8 α-氨基氮测定
• 4.1.9 芽孢计数和形态观察
• 4.1.10 粗料氮源的预水解发酵实验
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 不同水解度酪蛋白肽的制备
• 4.2.2 不同水解程度酪蛋白肽对发酵产酶影响
• 4.2.3 不同分子量分布的酪蛋白肽对胞外蛋白酶的诱导
• 4.2.4 发酵过程中α-氨基氮水平的变化
• 4.2.4 发酵过程中胞外物质分子量分布
• 4.2.5 补加氮源对发酵产酶速率的影响
• 4.2.6 粗料氮源预水解处理与发酵产酶
• 4.2.7 小罐发酵的优化控制
• 4.3 讨论
• 4.3.1 SYP A2-3 蛋白酶诱导机制
• 4.3.2 芽孢形成与产酶的关系
• 4.3.3 产酶控制策略
• 4.4 本章主要结论
• 第五章 冷适蛋白酶的分离纯化和酶学性质研究
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料和仪器
• 5.1.2 缓冲液
• 5.1.3 粗酶制备
• 5.1.4 离子交换层析
• 5.1.5 凝胶层析
• 5.1.6 纯度及活性检测方法
• 5.1.7 酶学性质实验
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 发酵液超滤浓缩
• 5.2.2 硫酸铵盐析
• 5.2.3 离子交换层析
• 5.2.4 凝胶层析
• 5.2.5 回收率和纯化倍数
• 5.2.6 BcNP 的酶学性质研究
• 5.3 讨论
• 5.3.1 BcNP 纯化过程中不稳定因素
• 5.3.2 BcNP 纯化的技术措施
• 5.3.3 影响BcNP 纯化收率的主要因素
• 5.3.4 BcNP 催化作用的冷适性
• 5.4 本章主要结论
• 第六章 BcNP 的稳定性和冷适应性研究
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 稳定性研究
• 6.1.2 紫外吸收光谱测定
• 6.1.3 荧光发射光谱测定
• 6.1.4 酶反应动力学常数测定
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 BcNP 的热稳定性
• 2+对BcNP 稳定性影响'>6.2.2 Ca²⁺对BcNP 稳定性影响
• 6.2.3 低分子量醇类对BcNP 稳定性的影响
• 6.2.4 低分子量醇类对酶活性的影响
• 6.2.5 低分子量醇类的添加对BcNP 紫外光谱的影响
• 6.2.6 低分子量醇类物质的添加对BcNP 荧光光谱影响
• 6.2.7 稳态理论对酶反应动力学方程的推导
• 6.2.8 不同温度下酶反应动力学常数测定
• 6.2.9 BcNP 在不同温度下的催化效能
• 6.2.10 酶反应热力学数据分析
• 6.3 讨论
• 6.3.1 稳定性保护的机制和限制性
• 6.3.2 有机溶剂对酶特性的影响
• 6.3 本章主要结论
• 第七章 冷适蛋白酶BcNP 同源建模和构效关系研究
• 7.1 材料和方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 N-端测序
• 7.1.3 引物设计和合成
• 7.1.4 DNA 提取和BcNP 基因的扩增、测序
• 7.1.5 BcNP 序列推定和序列分析
• 7.1.6 同源建模和结构评价的主要数据平台和工具软件
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 N-端测序和BcNP 序列
• 7.2.2 BcNP 的一级结构特点
• 7.2.3 BcNP 二级结构预测
• 7.2.4 BcNP 三级结构预测
• 7.2.5 BcNP 与1NPC 结构上的区别
• 7.3 讨论
• 7.3.1 同源模型的合理性和真实性
• 7.3.2 BcNP 结构上的柔韧性和不稳定
• 7.4 本章主要结论
• 论文的主要结论、展望和创新点
• 1. 论文主要结论
• 2. 论文主要创新点
• 3. 论文工作的不足及今后工作的展望
• 参考文献
• 已发表论文
• 致谢
• 独创性声明
• 学位论文版权使用授权书