N，O-二乙酰胞壁质酶R2基因的克隆及在枯草杆菌和毕赤酵母中的表达

论文摘要

本文根据GenBank中已登记N,O-二乙酰胞壁质酶R2基因序列设计引物,PCR扩增得到了R2酶成熟肽编码基因。将扩增产物与pMD 18-T载体连接,成功构建了重组质粒pMD 18-T-R2,经过双酶切及PCR验证,证明克隆到pMD 18-T载体上的外源基因即胞壁质酶R2基因。核苷酸序列测定表明,R2酶基因由655个碱基组成,与已报道的N,O-二乙酰胞壁质酶R2基因序列一致。对胞壁质酶R2基因进行了限制酶切图谱分析。 将pMD18-T-R2上的N,O-二乙酰胞壁质酶R2基因经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后,与经过相同酶切处理的pMA5载体连接,构建重组质粒pMA5-R2。然后将重组质粒pMA5-R2用SstⅠ酶切去除与表达无关的片段,自连后,连接产物转化枯草芽孢杆菌BCL1050,在卡那霉素抗性平板上筛选阳性转化子,并将此重组质粒命名为pMA5-R2-a。在筛选到的转化子中N,O-二乙酰胞壁质酶R2基因得到了较高水平的表达,酶活达到138U/mL。对转化子pMA5-R2-a/BCL1050发酵条件进行了优化,优化后酶活可达240U/mL。与以LB为培养基相比,酶活提高了1.75倍。对重组胞壁质酶的酶学性质进行了研究,发现与天然N,O-二乙酰胞壁质酶基本一致。 通过EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切,将N,O-二乙酰胞壁质酶R2基因按照质粒阅读框的转译方向插入到表达质粒pPIC9K的MCS中,构建重组表达质粒pPIC9K-R2。利用电转化方法转化表型为His-的毕赤酵母宿主菌株SMD1168,利用MD培养基初筛,再用MD、MM和（0.5-5mg/mL）G418的YPD平板筛选,获得1株具有4mg/mL的G418抗性,含高拷贝N,O-二乙酰胞壁质酶R2基因的MutsHis+重组毕赤酵母转化子。甲醇诱导表达,溶菌酶活性为156U/mL。对重组胞壁质酶的酶学性质进行了研究,发现与天然N,O-二乙酰胞壁质酶基本一致。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1. N，O-二乙酰胞壁质酶的研究进展
• 1.1 N，O-二乙酰胞壁质酶的生化性质
• 1.2 N，O-二乙酰胞壁质酶的分子生物学研究
• 1.3 N，O-二乙酰胞壁质酶的应用
• 1.3.1 食品工业上的应用
• 1.3.2 酶工程上的应用
• 1.3.3 在医学上的应用
• 1.4 溶菌酶基因 工程菌株研究现状
• 2. 枯草芽孢杆菌表达系统研究进展
• 2.1 芽孢杆菌的特点
• 2.2 芽孢杆菌表达系统的早期研究工作
• 2.2.1 枯草杆菌作为可转化菌株的发现
• 2.2.2 枯草杆菌的载体发现
• 2.3 枯草杆菌宿主菌株
• 2.4 枯草杆菌表达系统中的载体
• 2.4.1 自主复制质粒
• 2.4.2 噬菌体
• 2.4.3 染色体整合质粒
• 2.5 芽孢杆菌的基因表达特点
• 2.6 芽孢杆菌以表达的基因
• 2.7 芽孢杆菌表达系统存在的问题及今后发展方向
• 2.8 展望
• 3. 毕赤酵母表达系统研究进展
• 3.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的优点
• 3.2 毕赤酵母的生物学特性
• 3.3 毕赤酵母的遗传学特征
• 3.4 毕赤酵母表达外源蛋白
• 3.4.1 表达载体
• 3.4.2 载体的转化与整合
• 3.4.3 宿主菌
• 3.4.4 胞内表达和分泌表达
• 3.4.5 外源蛋白的糖基化
• 3.5 外源基因在P．pastoris中的高效表达策略
• 3.5.1 优化表达载体系统
• 3.5.1.1 载体的选择
• 3.5.1.2 选择强启动子
• 3.5.1.3 信号肽的选择
• 3.5.2 增加外源基因整合拷贝数
• 3.5.3 优化发酵条件，提高菌株的生物量来提高外源蛋白表达量
• 3.5.4 防止目的蛋白降解
• 3.6 展望
• 4. 本课题立体依据及前景分析
• 5. 本课题主要研究的内容、目的意义和技术路线
• 5.1 研究内容
• 5.2 研究目的
• 5.3 研究意义
• 5.4 主要技术路线
• 第二章 N，O-二乙酰胞壁质酶 R2基因的克隆与序列分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 培养基
• 1.3 培养基及培养条件
• 1.4 链霉菌染色体 DNA的提取
• 1.5 PCR反应引物的设计
• 1.6 PCR扩增反应
• 1.7 琼脂糖凝胶电泳及 DNA片段的回收、纯化
• 1.8 连接反应
• 1.9 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化反应
• 1.9.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.9.2 转化反应
• 1.10 重组质粒的筛选
• 1.11 重组质粒的鉴定
• 1.11.1 重组质粒 PCR鉴定
• 1.11.2 限制性酶切鉴定重组质粒
• 1.11.2.1 碱裂解法小量制备质粒 DNA
• 1.11.2.2 限制性核酸内切酶酶切技术
• 1.12 DNA测序及限制性酶切图谱的构建
• 2. 结果与讨论
• 2.1 N，O-二乙酰胞壁质酶 R2基因克隆
• 2.2 重组质粒pMD18-T-R2的构建
• 2.3 重组质粒 PMD18-T-R2的鉴定
• 2.4 胞壁质酶 R2基因限制性内切酶分析
• 3. 小结
• 第三章 N，O-二乙酰胞壁质酶 R2基因在枯草芽孢杆菌中表达的研究
• 1. 材料和方法
• 1.1 菌株和质粒载体
• 1.2 培养基
• 1.3 工具酶及生化试剂
• 1.5 芽孢杆菌质粒DNA提取
• 1.5.1 小量快速提取质粒DNA
• 1.5.2 大量提取质粒DNA
• 1.6 枯草芽孢杆菌转化技术
• 1.7 溶菌酶酶活测定方法
• 1.7.1 指示菌悬液的制备
• 1.7.2 液体溶菌活性测定
• 1.8 蛋白含量的测定（采用Bradford法测细胞蛋白含量）
• 2. 结果与讨论
• 2.1 枯草芽孢杆菌对卡那霉素的敏感性分析
• 2.2 枯草芽孢杆菌感受态转化法研究
• 2.3 重组质粒pMA5-R2和pMA5-R2-a的构建
• 2.4 重组质粒转化枯草芽孢杆菌
• 2.5 N，O-二乙酰胞壁质酶R2基因基因在枯草芽孢杆菌中表达的产酶曲线
• 2.6 重组溶菌酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达
• 2.7 最适作用温度及热稳定性
• 2.8 最适作用pH及pH稳定性
• 2.9 转化子BCL1050（pMA5-R2-a）发酵条件的研究
• 2.9.1 最佳碳源的选择
• 2.9.2 最佳氮源的选择
• 2.9.3 最佳培养温度的选择
• 2.9.4 最佳通气量的选择
• 2.10 讨论
• 第四章 N，O-二乙酰胞壁质酶R2基因在毕赤酵母中的分泌表达
• 1. 材料和方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 工具酶及生化试剂
• 1.3 培养基
• 1.4 引物设计
• 1.5 酶切、连接
• 1.6 重组子的筛选
• 1.7 大量制备质粒pPIC9K-R2
• 1.8 毕赤酵母的电转化
• 1.8.1 制备SMD1168感受态细胞
• 1.8.2 电转化 DNA样品的制备
• 1.8.3 电转化
• 1.9 毕赤酵母转化子的筛选
• +Mut^S阳性克隆'>1.9.1 筛选his⁺Mut^S阳性克隆
• 1.9.2 G418筛选高拷贝转化子
• 1.10 重组酵母的PCR鉴定
• 1.11 重组酵母的诱导表达
• 2 结果与分析
• 2.1 重组表达质粒pPIC9K-R2的构建
• 2.2 重组质粒pPIC9-R2双酶切验证
• 2.3 毕赤酵母的电转化
• 2.4 重组酵母 SMD1168-R2的筛选
• 2.5 含高拷贝溶菌酶基因的毕赤酵母电转化子的快速筛选
• 2.6 重组酵母 SMD1168-R2的PCR验证
• 2.7 重组酵母的诱导表达
• 2.8 重组胞壁质酶最适作用温度及热稳定性
• 2.9 重组胞壁质酶最适作用pH及 pH稳定性
• 2.10 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢