生物转化DL-乳酸生产丙酮酸的研究

论文摘要

丙酮酸作为许多化工产品及药物合成的前体物质,其市场需求日益扩大。本文基于2,4-二硝基苯肼显色原理和高效液相色谱（HPLC）法构建了高通量筛选方法。应用该方法,对能转化乳酸生产丙酮酸的微生物菌株进行了筛选。筛选得到了5株目的菌株,对其中的菌株ZJB-07166进行了鉴定,通过形态特征、ATB微生物鉴定系统（ID 32 E）和16S rDNA鉴定,确定该菌株为粘性沙雷氏菌（Serratia marcescens）。确定该粘性沙雷氏菌（Serratia marcescens）ZJB-07166所产乳酸转化酶为不依赖NADH的乳酸脱氢酶（NAD-independent lactate dehydrogenase）。论文考察了粘性沙雷氏菌（Serratia mamescens）ZJB-07166的培养和产酶条件,在较优的培养基（DL-乳酸钠1.0%,NH4Cl 0.32%、K2HPO40.1%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.00032%,pH7.0）中30℃摇床培养,可以显著提高粘性沙雷氏菌（Serratia marcescens）ZJB-07166的酶活力。实验结果表明粘性沙雷氏菌（Serratia marcescens）ZJB-07166所产酶是诱导型酶,其酶活力与细胞生长相关,并且在菌体培养的过程中能产生一种类似于灵杆菌素的红色色素。对粘性沙雷氏菌（Serratia marcescens）ZJB-07166转化条件的研究表明,转化体系中加入金属离子会增强菌体对产物的代谢,加入EDTA能增加产物丙酮酸的稳定性,转化反应的最适反应温度为30℃,菌株胞内乳酸脱氢酶酶活在30℃下的半衰期为84.5h,反应体系最适pH为6-8,底物浓度达到60mM以上会对转化产生明显的抑制作用,有机溶剂的加入会抑制酶活。通过流加底物转化48h后,最终产物浓度可达210mM。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1. 丙酮酸（盐）的用途
• 1.1.1 在医药化工方面的应用
• 1.1.2 在农业方面的应用
• 1.1.3 在食品添方面的应用
• 1.1.4 在日化工业方面的应用
• 1.1.5 其他方面的应用
• 1.2 丙酮酸的生产
• 1.2.1 化学法生产丙酮酸
• 1.2.2 发酵法生产丙酮酸
• 1.2.3 生物转化法生产丙酮酸的研究
• 1.3 本课题的研究意义
• 1.4 本课题的研究内容
• 参考文献
• 第二章 能转化DL-乳酸生产丙酮酸微生物菌种的选育
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 仪器设备
• 2.2.3 方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 丙酮酸的2，4-二硝基苯肼显色法检测
• 2.3.2 HPLC法检测
• 2.3.3 目的菌株筛选模型的建立
• 2.3.4 菌种筛选结果
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 能转化DL-乳酸生产丙酮酸微生物菌种的鉴定
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 培养基的配制
• 3.2.3 主要试剂和仪器
• 3.2.4 形态观察
• 3.2.5 ATB全自动鉴定
• 3.2.6 分子生物学鉴定
• 3.2.7 菌株ZJB-07166的产酶确定
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 形态观察
• 3.3.2 菌株的生理生化特征
• 3.3.3 16S rDNA序列的鉴定结果
• 3.3.4 菌株产酶的确定
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 粘性沙雷氏菌（Serratia marcescens）ZJB-07166发酵产酶培养条件优化
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料与仪器设备
• 4.2.2 方法
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 种子生长曲线
• 4.3.2 发酵培养过程
• 4.3.3 遗传稳定性
• 4.3.4 碳源的选择
• 4.3.5 碳源浓度的影响
• 4.3.6 氮源的选择
• 4.3.7 氮源浓度的影响
• 4.3.8 培养基初始pH的影响
• 4.3.9 接种量的影响
• 4.3.10 装液量的影响
• 4.3.11 培养温度的影响
• 4.3.12 硫酸镁的影响
• 4.3.13 响应面法优化培养条件
• 4.3.14 菌株所产色素
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 粘性沙雷氏菌（Serratia marcescens）ZJB-07166转化条件优化
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料与仪器设备
• 5.2.2 方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 金属离子对产物稳定性的影响
• 5.3.2 EDTA对产物稳定性影响
• 5.3.3 不同EDTA浓度对转化的影响
• 5.3.4 底物浓度对转化的影响
• 5.3.5 转化过程的研究
• 5.3.6 最适转化温度的确定
• 5.3.7 酶的温度稳定性
• 5.3.8 最适转化pH的确定
• 5.3.9 酶的pH稳定性
• 5.3.10 有机溶剂对转化的影响
• 5.3.11 底物流加后的产量
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 第六章 总结与展望
• 6.1 总结
• 6.2 展望
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文