2-萘酸加单氧酶基因及NADH:黄素还原酶基因的克隆与分析

论文摘要

偶氮芳香族化合物在自然界广泛存在,而且每年以数百万吨的数量被制造出来。许多偶氮芳香族化合物在化工工业上有重要用途,但该类化合物在使用过程中往往会造成严重的环境污染。2-萘酸是一种在化学结构上类似偶氮芳香族物质基本结构萘磺酸的化合物,研究2-萘酸的微生物代谢途径,确定其代谢过程中的酶系统以及对应的代谢基因,可以为偶氮类化合物的微生物降解提供理论依据,为通过基因工程技术构建多功能高效的环境污染物降解菌创造条件。伯克霍尔德氏菌（Burkholderia sp.）JT1500 是一株2-萘酸（2-naphthoate）降解菌,通过该菌株的转化作用,1mol 的2-萘酸可被转化为1mol 的丙酮酸,1mol 的琥珀酸,1mol 的乙酰CoA 和2mol 的CO2, 在该过程中2-萘酸生物降解的关键步骤之一是通过2-萘酸加单氧酶羟化2-萘酸生成1-羟基-2-萘酸（1-hydroxy-2-naphthoate）。本研究对含有该2-萘酸加单氧酶基因的一个4.8kb 长度的基因簇进行了克隆测序,该序列上可合理地读出4 个阅读框orfB、orfC、orfD、orfA。序列比对发现,orfA 序列与Japonicum USDA 110 和Rastonia eutropha HF 39 中的加单氧酶基因同源性较高,orfB 序列与Bordetlla pertussis Tohama I 、Rastonia solanacearum GMI1000 和Bordetella bronchiseptica RB50 等菌中的黄素还原酶基因有一定的同源性。采用根据DNA 序列信息设计相应引物,分别构建含有不同阅读框的重组子,对不同阅读框编码的基因功能进行了确定。酶活分析发现只含基因orfA 的重组大肠杆菌SA的细胞提取液有很低的加氧活性,含基因orfB 的重组子SB的细胞提取液没有加氧活性,但在反应体系中同时加入SA和SB的细胞提取液后,其加氧活性显著增强,包含orfB+orfA 的重组子SB+A 在黄素（FMN、FAD）存在的条件下也表现出很强的加氧活性;在厌氧条件下,能检测出SB细胞提取液的黄素还原活性。基于以上信息,可以认定2-萘酸加单氧酶基因nmo 是由黄素还原酶基因（nmoB）和加单氧酶基因（nmoA）组成,由2-萘酸加单氧酶Nmo 羟化2-萘酸的关键一步应为:先由黄素还原酶（NmoB）在NADH 存在的条件下将黄素（FMN、FAD）还原为还原型黄素（FMNH2、FADH2）,然后2-萘酸加单氧酶（NmoA）利用还原型黄素和分子O2羟化底物2-萘酸,生成1-羟基-2-萘酸。NmoB 是NmoA 的偶联蛋白。该2-萘酸加单氧酶的发现为双组分非亚铁血红素型黄素扩散加单氧酶（TC-FDM, two-component nonheme flavin-diffusible monooxygenase）家族增添了新成

论文目录

• Abbreviations
• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 选题背景
• 1.2 芳香族化合物的生物降解
• 1.2.1 苯的降解
• 1.2.2 取代苯的降解
• 1.2.3 联苯的降解
• 1.2.4 多环芳烃的降解
• 1.3 厌氧代谢、好氧代谢
• 1.4 芳香族化合物代谢中的主要酶
• 1.4.1 芳环羟基化双加氧酶
• 1.4.1.1 铁氧还蛋白还原酶
• 1.4.1.2 铁氧还蛋白
• 1.4.1.3 末端氧化酶组分
• 1.4.2 芳环断裂双加氧酶
• 1.5 芳香烃降解酶的分子生物学研究
• 1.5.1 基因簇分析
• 1.5.2 基因表达的调控
• 1.6 本研究目的基因的来源
• 1.7 本研究的目的、意义
• 1.8 国内外研究动态及本研究组前期研究发现的问题
• 第二章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株、质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 各种试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒提取方法
• 2.2.2 PCR 产物纯化
• 2.2.3 酶切反应
• 2.2.4 连接反应
• 2.2.5 制备大肠杆菌感受态细胞
• 2.2.5.1 受体菌的培养
• 2.2.5.2 感受态细胞的制备
• 2.2.6 转化
• 2.2.7 酶活性测定
• 2.2.7.1 靛蓝生成实验
• 2.2.7.2 制备细胞提取液
• 2.2.7.3 萘酸单加氧酶活性的测定
• 2.2.7.4 黄素还原酶活性在厌氧条件下检测
• 2.2.7.5 底物2-萘酸的转化
• 2.2.7.6 考马斯亮兰法(Bradford 法
• 2.2.7.7 蛋白浓度的测定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 序列分析结果
• 3.2 相关重组子的构建
• 3.2.1 重组子pUCEK/EK4.4 的构建
• 3.2.2 重组子185al/SS3.0 的构建
• 3.2.3 重组子pEX12 的构建
• 3.2.4 orfB 的克隆
• 3.2.4.1 orfB 的 DNA 序列
• 3.2.4.2 克隆orfB 的设计引物
• 3.2.4.3 扩增orfB 的聚合酶反应条件
• 3.2.4.4 扩增程序
• 3.2.5 orfA 的克隆
• 3.2.5.1 orfA 的DNA 序列
• 3.2.5.2 克隆orfA 的引物设计
• 3.2.5.3 扩增orfA 的聚合酶反应条件
• 3.2.5.4 扩增程序
• B+A的构建'>3.2.6 重组子 S_B+A的构建
• 3.3 酶活性测定结果
• 3.3.1 靛蓝生成实验结果
• 3.3.2 NADH 法测定加氧酶活性结果
• 3.3.3 黄素还原酶活性测定结果
• 3.3.4 HPLC 法测定底物转化结果
• 第四章 讨论
• 4.1 加氧酶基因家族
• 4.2 2-萘酸加单氧酶基因调控2-萘酸生物降解作用机理
• 第五章 小结
• 参考文献
• 致谢
• 原创性声明