苏云金芽胞杆菌新异杀虫晶体蛋白基因的克隆与基因工程菌WG-001的安全评估

论文题目: 苏云金芽胞杆菌新异杀虫晶体蛋白基因的克隆与基因工程菌WG-001的安全评估

论文类型: 硕士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 张振宇

导师: 孙明

关键词: 苏云金芽胞杆菌,晶体蛋白基因,基因组文库,苏云金芽胞杆菌基因,工程菌,安全评估

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 新的苏云金芽胞杆菌晶体蛋白的克隆对于控制害虫对苏云金芽胞杆菌杀虫剂的抗性和研究晶体蛋白对苏云金芽胞杆菌的生物学意义等理论研究都具有重要意义。在本文第一部分中，在以往从“无毒”菌株中发现其晶体蛋白对特定生物体具有毒杀作用的诸多实例的启发下，以实验室保藏菌种材料中部分晶体蛋白成分较新异且未发现杀虫活性的菌株为研究对象，进行了晶体蛋白基因的克隆，并成功的从华中亚种的标准菌株YBT978中成功的克隆到cry7Ba1，为cry7群中新亚群，其表达产物对小菜蛾具有高效杀虫活性；这为寻找新异杀虫晶体蛋白基因开辟了新的思路。本文第二部分进行了苏云金芽胞杆菌基因工程菌WG-001的安全评估，包括工程菌WG-001的定植能力、传播扩散能力、对土著微生物的影响、遗传变异能力以及特异基因cry1Aa和cry1Ac水平转移能力五个方面的内容，初步证明其对南方蔬菜地土壤环境有很高的安全性，为其推广应用提供了安全性实验数据支持。具体结果如下： 1．筛选出BMB1518、YBT978、L60、NXP15-04、PBt53、HZ39-04、LT1L-57、NARCBt17、EA15196、EA14696、T70。其中，BMB1518、YBT978、L60、NXP15-04、EA15196的晶体蛋白已转至PVDF膜，BMB1518的45kD晶体蛋白、YBT978的130kD晶体蛋白、EA15196的42kD晶体蛋白已测得N-末端15个氨基酸序列。 2．构建了YBT978的基因组BAC文库。同时根据YBT978的130kD晶体蛋白N-末端15个氨基酸序列，采用结合接头的PCR扩增方法获得了此130kD晶体蛋白对应基因N-端的DNA序列，据此设计了引物130A1-2和130S1-2，用于从YBT978的基因组BAC文库中筛选含有130kD晶体蛋白基因的克隆子。对得到的阳性克隆子进行亚克隆，最终获得了3465bp的130kD晶体蛋白基因编码区，并预测了RBS序列和BtⅠ、BtⅡ重叠双启动子，终止子，以及全部的8个保守区。此多肽与其它已知的Cry与Cyt蛋白的氨基酸序列比较结果表明它与Cry7Ab2最相似，identity达到了58.2％；其中，其C-端序列非常相似，identity为87.9％，而N-端序列的相似度较低，identity为37.1％。此晶体蛋白已被杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为Cry7Ba1，为Cry7群的新亚群。将cry7Ba1转入无晶体突变株CryB，能形成晶体蛋白与野生菌株YBT978形状和大小相似的双金字塔形伴胞晶体，其晶体蛋白成分为预期的130kD大小。生测结果表明，伴胞晶体无毒的YBT978表达的Cry7Ba1蛋白在体外溶解后对小菜蛾具有高毒力。由于Cry的N-端为其毒力核心区域，因此根据Cry7Ba1的N-端与已知Cry的相似度很低的特点，推测此晶体蛋白识别昆虫中肠上皮细胞上新异的受体，具有很高的开发价值。cry7Ba1的发现从一定程度上预示在众多被认为“无毒”的苏云金芽胞杆菌中蕴藏着丰富的杀虫晶体蛋白基因资源，为寻找杀虫晶体蛋白提供了新的思路。

论文目录:

摘要

Abstract

1.苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的克隆与分析

1.1 前言

1.1.1 苏云金芽胞杆菌的简介

1.1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白及其基因

1.1.3 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的命名与分类

1.1.4 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的杀虫机制

1.1.5 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的结构与功能

1.1.6 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的表达与调控

1.1.7 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白之间以及与其他晶体蛋白之间的相互作用

1.1.8 目标昆虫对苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的抗性以及防治措施

1.2 研究目的

1.3 材料与方法

1.3.1 实验材料

1.3.2 实验方法

1.4 结果与分析

1.4.1 新型杀虫晶体蛋白基因克隆材料的筛选

1.4.2 对BMB1518与EA15196晶体蛋白N-末端氨基酸序列的分析和基因的克隆

1.4.2.1 BMB1518的45kD晶体蛋白N-末端氨基酸序列的分析和基因克隆

1.4.2.2 EA15196的42kD晶体蛋白N-末端氨基酸序列的分析和基因克隆

1.4.3 YBT978的130kD晶体蛋白的克隆

1.4.3.1 YBT978的130kD晶体蛋白基因N-末端片断的PCR扩增与测序

1.4.3.2 YBT978基因组BAC文库的构建与筛选

1.4.3.3 YBT978基因组BAC文库阳性克隆子的亚克隆

1.4.4 YBT978的130kD晶体蛋白基因序列的分析

1.4.5 cry7Bal在无晶体突变株中的表达

1.4.6 生物测定的结果以及分析

1.4.6.1 生物测定的结果

1.4.6.2 cyt类基因的检测

1.4.6.3 YBT978晶体蛋白的溶解特性

1.5 结果与讨论

1.5.1 本部分的实验结果总结如下：

1.5.1.1 对实验室保藏菌株筛选的结果

1.5.1.2 BMB1518的研究结果

1.5.1.3 EA15196的研究结果

1.5.1.4 YBT978基因组BAC文库的构建和筛选

1.5.1.5 cry7Bal基因的克隆及分析

1.5.2 讨论

2.苏云金芽胞杆菌基因工程菌WG-001的安全性评估

2.1 前言

2.1.1 苏云金芽胞杆菌杀虫剂的发展现状

2.1.2 苏云金芽胞杆菌转基因工程菌的研究现状

2.1.3 转基因生物的安全性问题

2.1.4 植物用转基因微生物的安全性问题

2.1.5 转基因微生物生物安全研究方法

2.1.6 植物用转基因微生物安全性评价的主要内容

2.2 研究目的和意义

2.3 材料和方法

2.4 结果与分析

2.4.1 工程菌WG-001和1125BG在喷药区的消长动态

2.4.1.1 工程菌WG-001在农田叶面上的消长动态

2.4.1.2 工程菌WG-001在农田土壤中的消长动态

2.4.1.3 工程菌WG-001和1125BG在盆栽土壤中的消长动态

2.4.2 工程菌WG-001的水平扩散

2.4.2.1 工程菌WG-001在空气中的水平扩散

2.4.2.2 工程菌WG-001在农田叶面上的水平扩散

2.4.2.3 工程菌WG-001在农田土壤中的水平扩散

2.4.2.4 工程菌WG-001在农田地下水中的水平扩散

2.4.3 工程菌WG-001在农田土壤中的垂直扩散

2.4.4 工程菌WG-001和1125BG对土壤中土著微生物群落的影响

2.4.4.1 工程菌WG-001对农田土壤中土著微生物群落的影响

2.4.4.2 工程菌WG-001和1125BG对盆栽土壤土著微生物群落的影响

2.4.5 工程菌WG-001的遗传稳定性

2.4.6 工程菌WG-001和1125BG的特异基因对土著微生物的水平扩散

2.5 讨论与结论

2.5.1 讨论

2.5.1.1 工程菌WG-001和1125BG的生存能力

2.5.1.2 工程菌WG-001的传播扩散能力

2.5.1.3 工程菌WG-001和1125BG对土著微生物的影响

2.5.1.4 工程菌WG-001和1125BG特异基因对土壤土著微生物和盆栽作物的水平转移

2.5.1.5 应用gfp报告基因的效果

2.5.2 结论

参考文献

致谢

发布时间: 2006-12-12

参考文献

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