大肠杆菌xylA和xylB基因的克隆与表达

论文摘要

随着人们对全球性能源危机认识的不断加深及环境保护意识的不断加强,开发新的替代能源已是刻不容缓的重大战略问题。生物乙醇作为一种可再生的替代能源,日益受到各国的重视。如何利用廉价生物质等可再生资源进行生物乙醇生产已成为各国的研究热点之一。本中心在这样的背景下进行Zymomonas mobilis基因工程改造,使其能发酵木糖生产乙醇。本文研究内容为中心大课题的一部分,即克隆并表达大肠杆菌木糖异构酶基因（xylA）与木酮糖激酶基因（xylB）。首先通过紫外诱变、Ap富集与X-EMB平板筛选得到木糖营养缺陷型菌株787。通过PCR反应克隆大肠杆菌K12 xylAB,PCR产物以pBSKS（+）为载体引入菌株787,经筛选平板筛选和转化子酶活测定判断克隆得到的DNA片段即为目的片段xylAB。测序结果进一步证明克隆得到的DNA片段为目的片段xylAB。然后将xylAB与穿梭质粒pZB1相连构建成pZB1-xylAB质粒,并转化DH5α与Z.mobilis CP4。最后,利用PCR重叠延伸技术将大肠杆菌xylAB自身的启动子换成Z.mobilis CP4的gap基因的启动子,构建成pZB1-Pgap-xylAB,并分别转化DH5α与Z.mobilis CP4。通过半胱氨酸-咔唑的方法测定菌株粗酶液的XI酶活,D-木酮糖-NADH耦联法测定XK酶活,结果表明:大肠杆菌DH5α（pZB1-xylAB）XI酶活为DH5α（pZB1）的2倍,而XK酶活为DH5α（pZB1）的100倍,DH5α（pZB1-Pgap-xylAB）的XI酶活是DH5α（pZB1）的3倍,而XK酶活约为DH5α（pZB1）的824倍;说明运动发酵单胞菌gap基因的启动子也能被大肠杆菌有效识别并启动转录。

论文目录

• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 微生物木糖利用的研究
• 1.2 大肠杆菌D-木糖操纵子的研究
• 1.3 木糖利用基因工程菌的研究
• 1.3.1 Zymomonas mobilis
• 1.3.2 Escherichia coli
• 1.3.3 其它
• 1.4 本课题的研究目的、研究内容
• 1.4.1 研究目的
• 1.4.2 研究内容
• 1.5 技术路线
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 蛋白质测定用试剂
• 2.1.4 木糖异构酶酶活测定用试剂
• 2.1.5 木酮糖激酶酶活测定用试剂
• 2.1.6 培养基和补充添加物
• 2.1.7 PCR 反应用引物
• 2.1.8 分子生物学操作常用溶液配制
• 2.1.9 主要设备及仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌体培养
• 2.2.2 大肠杆菌生长曲线测定
• 2.2.3 氨苄青霉素（Ap）富集和X-EMB平板筛选木糖营养缺陷型突变株
• 2.2.4 考马斯亮蓝G-250 染色的方法测定蛋白质浓度
• 2.2.5 木糖异构酶酶活测定
• 2.2.6 木酮糖激酶酶活测定
• 2.2.7 PCR 反应
• 2.2.8 酶切反应
• 2.2.9 电泳分析
• 2.2.10 核酸的乙醇沉淀纯化、回收
• 2.2.11 脱磷反应
• 2.2.12 连接反应
• 2.2.13 感受态细胞的制备
• 2.2.14 重组质粒大肠杆菌感受态细胞转化与转化子的筛选
• 2.2.15 重组质粒电穿孔转化Z．mobilis CP4 和转化子的筛选
• 2.2.16 质粒的提取
• 2.2.17 目的条带的回收
• 第三章 实验结果与讨论
• 3.1 木糖营养缺陷型菌株的构建
• 3.1.1 E．coli CSH25-1 菌株生长曲线测定
• 3.1.2 紫外诱变和Ap 富集
• 3.1.3 木糖营养缺陷型菌株的筛选
• 3.1.4 木糖营养缺陷型菌株的酶活测定
• 3.2 E．coli K12 xylAB 基因的克隆
• 3.2.1 模板的制备
• 3.2.2 PCR 反应克隆xylAB
• 3.2.3 连接、转化、筛选与鉴定
• 3.2.4 重组质粒pBSKS（+）-xylAB 转化DH5a 及克隆片段测序
• 3.3 E．coli K12 xylAB 在CP4 中的表达
• 3.3.1 pZB1-xylAB 质粒的构建
• 3.3.2 pZB1-Pgap-xylAB 质粒的构建
• 3.3.3 xylAB 和Pgap-xylAB 在CP4 中的表达
• 第四章 结论
• 4.1 结论
• 4.2 建议
• 符号表
• 参考文献
• 附录一 E．coli CSH25-1 菌株生长曲线测定的原始实验记录
• 附录二 Ap 处理及筛选木糖营养缺陷型突变株的原始实验记录
• 附录三 文中涉及到的质粒及有关基因物理图谱
• 附录四 xylAB 测序结果
• 附录五 gap-ATG-xx/SalⅠ测序结果
• 发表论文情况
• 致谢