绿竹BoYAB1基因克隆与功能分析

绿竹BoYAB1基因克隆与功能分析

论文摘要

YABBY基因家族参与了调控叶背腹极性发育,它们在决定侧生器官极性分化方面起重要作用。本研究从绿竹(Bambusa oldhami)中分离了BoYABBY1(BoYAB1)基因,并对其进行了表达模式和功能分析。主要结果如下:(1)从绿竹中克隆到了长度为766bp的cDNA序列,其中包括开放阅读框ORF(Open Reading Frame)为504bp,编码167个氨基酸。具有典型的YABBY基因家族结构,N端为zinc finger-like Domain,C端为YABBY Domain。(2)BoYAB1与其他物种YABBY基因家族的氨基酸序列进行比对,结果表明BoYAB1与FIL、GRAM、OsYAB2、TaYAB1、ZYB9和ZYB10的同源性分别为24.8%、57.5%、67.8%、39.9%、37.2%和37.5%。与毛竹(Phyllostachys pubescens)的属于YABBY家族的六个基因进行氨基酸同源性分析,BoYAB1与bphyem102c、bphyem104c、bphyem110b、bphylf026i、bphylf046c和bphyst007p的同源性分别为:47.4%、45.2 %、26.6 %、32.1 %、46.4 %和45.8 %。(3)系统进化树表明,BoYAB1与水稻的OsYAB1和OsYAB2,拟南芥的YAB2、YAB5和金鱼草的PROL有较近的亲缘关系。(4)构建了植物表达载体,转基因至拟南芥,转基因植株有两种表型,温和表型和严重表型。前者莲座叶背向性生长,开花时间约晚10天,植株出现矮化现象;后者莲座叶部分背向性,部分腹向性生长,且全部不能抽苔。(5)通过实时定量PCR,BoYAB1基因在绿竹的开花试管苗和营养生长试管苗中均有表达,前者的表达量约为后者的25倍。结果表明BoYAB1基因可能与绿竹成花有关。(6)原位杂交表明,BoYAB1转录本在绿竹开花试管苗的雄蕊原基和心皮原基中大量表达。结果表明BoYAB1基因可能与花器官的发育有一定的关系。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 竹子成花机理的研究现状
  • 1.2 极性建立
  • 1.3 调控近远轴面的基因
  • 1.3.1 MYB 基因家族
  • 1.3.2 HB 基因家族
  • 1.3.3 GARP 基因家族
  • 1.3.4 LOB 基因家族
  • 1.3.5 YABBY 基因家族
  • 1.3.5.1 双子叶植物
  • 1.3.5.2 单子叶植物
  • 1.4 研究目的与意义
  • 第二章 材料与方法
  • 2.1 实验材料和试剂
  • 2.1.1 植物材料及其生长条件
  • 2.1.2 菌株
  • 2.1.3 质粒
  • 2.1.4 主要试剂
  • 2.1.5 主要仪器
  • 2.1.6 引物
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 植物组织DNA 的提取
  • 2.2.2 植物组织总RNA 的提取
  • 2.2.3 cDNA 第一条链的合成
  • 2.2.4 胶回收
  • 2.2.5 转化
  • 2.2.5.1 化学转化法
  • 2.2.5.2 电击法
  • 2.2.6 绿竹BoYAB1 基因的克隆
  • 2.2.7 生物信息学分析
  • 2.2.8 植物表达载体的构建
  • 2.2.9 电转化农杆菌GV3101 及检测
  • 2.2.10 拟南芥的遗传转化
  • 2.2.10.1 拟南芥的种植
  • 2.2.10.2 拟南芥的遗传转化
  • 2.2.10.3 转基因种子的筛选及种植
  • 2.2.11 转基因拟南芥植株的PCR 鉴定
  • 2.2.12 转基因植株的RT-PCR 半定量检测
  • 2.2.13 实时荧光定量PCR
  • 2.2.13.1 Bo YAB1 标准曲线的绘制
  • 2.2.13.2 Actin 标准曲线的绘制
  • 2.2.14 原位杂交
  • 2.2.14.1 石蜡切片
  • 2.2.14.2 探针的制备
  • 2.2.14.3 探针的水解
  • 2.2.14.4 探针的检测
  • 2.2.14.5杂交
  • 第三章 结果与分析
  • 3.1 BoYAB1 基因的克隆
  • 3.1.1 绿竹基因组DNA 和总RNA 的提取
  • 3.1.2 Bo YAB1 基因的克隆
  • 3.2 生物信息学分析
  • 3.2.1 Bo YAB1 的氨基酸组成及理化性质
  • 3.2.2 BoYAB1 同源氨基酸序列比对及系统进化树分析
  • 3.3 Bo YAB1 基因的分析表达
  • 3.3.1 实时荧光定量PCR
  • 3.3.2 原位杂交
  • 3.4 BoYAB1 基因的功能验证
  • 3.4.1 双元表达载体构建
  • 3.4.1.1 BoYAB1 基因编码区的分离、克隆和测序
  • 3.4.1.2 植物表达载体的构建与鉴定
  • 3.4.2 拟南芥遗传转化与功能分析
  • 3.4.2.1 电转化农杆菌 GV3101 及检测
  • 3.4.2.2 拟南芥遗传转化
  • 3.4.2.3 转基因植株的 PCR 检验
  • 3.4.2.4 半定量 RT-PCR 分析
  • 第四章 讨论
  • 4.1 试验方法讨论
  • 4.1.1 拟南芥的种植
  • 4.1.2 拟南芥的遗传转化
  • 4.1.3 原位杂交
  • 4.2 实验结果与讨论
  • 第五章 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 个人简介
  • 发表论文情况
  • 相关论文文献

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