红肉脐橙自剪机理的研究

论文摘要

自剪又名顶芽自枯,是植物枝条在生长发育过程中其顶端自然脱落或死亡的过程,是较多植物共有的一种生物学现象,草本植物如番茄、辣椒,木本植物如柑橘、石榴、柿树、桃树、李树、腊梅等,但其发生机制与确切的生物学意义尚不甚明了。实验室前期研究发现,自剪是枝条发育的分界点,与花芽分化有着密切的关系,对有成花能力的枝条,自剪后花芽分化启动；而没有成花能力的枝条在自剪后形成叶芽。因此,自剪可能是枳花芽分化启动的触发点。本课题以红肉脐橙为实验材料,从细胞水平上对离区组织进行了结构分析,从分子水平对相关基因进行了表达分析。主要结果如下：1.通过试验处理和实验观察发现,柑橘自剪时枝梢的长度和节数有很大的差异,童期柑橘和成年期柑橘自剪时的枝梢长度和节数更是有很明显的不同。对成年期柑橘自剪时的枝梢而言,短的有4cm约3个节位,长的可达60cm约20个节位。通过对成年期红肉脐橙的枝梢自剪时的统计发现,待自剪发生时,新梢已经抽出10片真叶左右。新梢自剪的部位又是相对固定的,大多维持在某一先出叶的叶腋处。2.通过组织切片分析发现,顶芽尚未脱落之前,脱落器官的基部就已分化出离区,以后在离区的范围内进一步分化出离层和保护层。离区是由5-20层小细胞组成的一个完整的贯穿整个脱落部位的细胞层,胞质致密、胞间隙小。对红肉脐橙而言,离层细胞比邻近细胞小,大多为长方形,离层形成后的1-5d内发生自剪。3.基因芯片分析发现,自剪时与细胞衰老相关的EST其表达量有所上调。通过TUNEL对柑橘自剪时的细胞凋亡检测发现,柑橘顶芽自枯时伴随着细胞程序性死亡（PCD）的发生。在自剪部位及小叶脱落部位可检测到不同程度的绿色荧光。4.通过基因芯片分析得知,自剪时,多种病程相关蛋白如几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶含量降低,自剪后上调。可能是机体内部通过下调局部器官的抗逆性进而促进自剪的完成。5.通过原位杂交对CiFLC, CiCEN, CiAP1的时空表达检测发现,它们与柑橘自剪似乎并不存在因果关系。在器官的脱落部位没有检测到杂交信号,其表达信号主要集中在顶端分生组织（SAM）和腋芽分生组织中。前人研究发现,自剪时CiCEN,CiAPl表达量下调,可能是由于自剪导致局部器官的营养生长减弱,进而引起与SAM的营养生长相关基因的下调表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 问题的提出
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 植物枝条的发生方式
• 1.2.2 器官脱落及其生理生化过程
• 1.2.3 激素对离层形成的影响
• 1.2.4 离层形成的生理意义
• 1.2.5 离区发育相关基因研究
• 1.2.5.1 拟南芥离区发育相关基因的研究
• 1.2.5.2 水稻离区发育基因
• 1.2.5.3 番茄离区发育相关基因
• 1.3 细胞程序性死亡
• 1.3.1 细胞凋亡的研究
• 1.3.2 TUNEL法检测细胞凋亡
• 1.4 本研究的目的和内容
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 试剂和仪器
• 2.1.3 细菌培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物材料准备
• 2.2.2 蜡切片
• 2.2.3 荧光定量PCR
• 2.2.3.1 总RNA提取
• 2.2.3.2 RNA质量检测
• 2.2.3.3 提取RNA的纯化
• 2.2.3.4 RNA的反转录
• 2.2.3.5 反转录产物的PCR检测
• 2.2.3.6 定量分析
• 2.2.4 原位杂交
• 2.2.4.1 探针引物设计及PCR扩增
• 2.2.4.2 扩增产物回收
• 2.2.4.3 目的片段的AT克隆
• 2.2.4.4 质粒DNA的提取
• 2.2.4.5 质粒DNA的酶切
• 2.2.4.6 酶切产物的回收
• 2.2.4.7 转录探针
• 2.2.5 基因芯片
• 2.2.6 TUNEL检测
• 3 结果与分析
• 3.1 自剪前后的形态变化
• 3.1.1 自然状态下发生的自剪
• 3.1.2 受伤后发生的自剪
• 3.1.3 自剪发生的部位
• 3.2 自剪前后的细胞学变化
• 3.2.1 顶芽形态变化
• 3.2.2 离区的形成
• 3.3 细胞程序性死亡（PCD）检测
• 3.4 自剪过程基因芯片检测和相关基因表达分析
• 3.4.1 自剪前后基因芯片检测
• 3.4.2 自剪相关基因实时定量分析
• 3.4.3 自剪相关基因原位杂交分析
• 4 讨论
• 4.1 柑橘自剪部位不是固定不变的
• 4.2 离区的形成
• 4.3 自剪发生相关基因
• 4.4 顶芽自剪与细胞程序性死亡
• 4.5 自剪调控机制
• 参考文献
• 附录
• 致谢