论文摘要
[目的]：运用实时荧光定量PCR法,建立稳定、快速、准确的运动神经元生存基因（survival motor neuron 1, SMN1）的定量方法,并将其运用于脊肌萎缩症（spinal muscular atrophy, SMA）携带者的筛查,同时评价SMA携带者筛查在SMA的基因诊断和产前诊断中的应用价值。[方法]：以TaqMan技术为基础,运用特异性的MGB探针方法,同时选择Ⅷ因子的外显子3作为内参基因对样本的DNA初始浓度进行均一化校正。建立标准品,将标准品和待测样本同时分管扩增SMN1基因与Ⅷ因子,优化反应条件,设计标准化检测程序,以梯度稀释的标准品构建SMN1基因与Ⅷ因子的标准曲线。通过Ct值和标准曲线的关系对待测样品的SMN1与Ⅷ的反应起始模板进行定量分析,进而获得样品基因组内SMN1的拷贝数。为了验证RQ-PCR的重复性与稳定性,分别对男女携带者、男女正常对照四个不同样本进行批间和批内比较;同时,通过对48例经RFLP-PCR法确诊的SMA患者及20例经连锁分析法确定的肯定携带者进行了检测,验证该技术的特异性与可靠性。本研究通过检测SMN1的拷贝数对200例普通人群、26例SMA患者的父母及16例胎儿进行了SMA携带者筛查。[结果]：1.在定量SMN1基因的重复性与稳定性实验中,我们获得了肯定携带者的批间与批内拷贝数区间分别为[0.73-1.15]和[0.77-1.05],正常对照的批间与批内拷贝数区间分别为[1.70-2.18]和[1.68-1.98]；在特异性与可靠性实验中,48例SMA患者样本的SMN1拷贝数为0,20例肯定携带者的拷贝数范围为0.71-1.15,平均拷贝数为0.90±0.135。2.200例普通人群中,4例为含有1拷贝的SMN1基因携带者,其拷贝数范围为0.75-1.05,平均拷贝数为0.88±0.162,与SMN1肯定携带者的范围一致：194例拷贝数范围为1.60-2.18,平均拷贝数为1.88±0.156,为非携带者：其余2例SMN1基因/Ⅷ因子比值分别为3.09与3.22,平均拷贝数为3.16±0.092,是含有3拷贝SMN1基因的携带者。3.在26例父母样本中,25例拷贝数范围为0.61-1.16,平均拷贝数为0.91±0.163,96.1%为携带者：仅1例的拷贝数为1.82,3.9%符合双拷贝范围。4.在16例胎儿样本中,其中10例拷贝数范围为1.62-2.11,平均拷贝数为1.88±0.147,为非携带者,其余6例的拷贝数区间为0.73-1.10,平均拷贝数为0.90±0.194,为SMN1基因缺失携带者。[结论]：1.实时荧光定量PCR可用于SMN1基因定量检测,结果准确可靠、简单实用、并且能实现自动化和规模化检测体系。2.SMA携带者与非携带者中SMN1基因的拷贝数区间不同,定量分析SMN1基因拷贝数可用于SMA携带者的筛查。3. SMA携带者筛查的应用对SMA的遗传咨询、遗传风险评估、遗传诊断等方面有着重要的科学价值和临床意义,并且为SMA的基因诊断和产前诊断提供重要依据。