论文摘要
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是结核病的病原体,全世界大约有1/3人口感染或携带这种杆菌。从上世纪末开始,由于耐多药甚至广泛耐药结核分枝杆菌的出现使已经得到控制的结核病发病率又呈现逐年上升趋势。因此,寻找新的抗结核药物的靶点是当前结核病研究的主要任务之一。结核分枝杆菌细胞壁具有独特的结构,对于维持细胞的生存和繁殖有非常重要的作用。其细胞壁的核心结构由三种大分子组成,由外至内分别为分枝菌酸、聚阿拉伯半乳糖和肽聚糖。其中聚阿拉伯半乳糖与肽聚糖之间是通过L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺（L-rhamnose-D-N-GlcNAc）衔接双糖共价连接起来的,这个衔接双糖对于维持结核分枝杆菌细胞壁的完整性有极其重要的作用。L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺衔接双糖合成的第一步反应是将糖基供体UDP-N-乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc）的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸（GlcNAc-1-P）基团转移到脂类载体C50-P（Decaprenyl phosphaye）上形成C50-P-P-GlcNAc,此反应由N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶催化完成。N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶对于衔接双糖的合成有至关重要的作用,一旦该酶被抑制或缺失,衔接双糖将不能合成。在大肠杆菌中wecA基因编码的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶（WecA）参与脂多糖（LPS）中O-抗原多糖的合成。本实验室通过对大肠杆菌wecA基因敲除菌株MV501中LPS合成的补偿实验,证实了结核分枝杆菌Rv1302基因是WecA的编码基因wecA;并构建了耻垢分枝杆菌wecA基因敲除菌株,通过测定其生长曲线和使用电镜观察其形态学和细胞结构变化,证明了wecA是分枝杆菌生长必需基因。由此可见,WecA是研发抗结核药物的一个非常好的潜在靶点。通过对结核分枝杆菌WecA的结构预测,WecA是一个具有11个跨膜结构域的膜蛋白。由于其结构的复杂性,难于在E. coli宿主细胞中获得高表达的WecA膜蛋白,也不便对WecA膜蛋白进行纯化。目的:1.用pET16b-Tb wecA表达载体在E. coli ER2566菌株中表达WecA膜蛋白并进行纯化;2.建立WecA酶活性分析方法,分别使用薄层层析（TLC）和高效液相色谱（HPLC）技术对WecA酶活性进行鉴定;3.尝试WecA膜蛋白表达的其它方法,包括构建pCold-Tb wecA表达载体,在E. coli MV501菌株中低温诱导WecA膜蛋白的表达;获取删除5’端的wecA基因,构建pET29b-Tb wecA del1和pET29b-Tb wecA del2表达载体,在多种大肠杆菌表达菌株中表达N末端截短的WecA膜蛋白;使用MembraneMax Protein Expression Kit在体外表达WecA膜蛋白。结果:1.用pET16b-Tb wecA表达载体在E. coli ER2566菌株中表达WecA膜蛋白并纯化出WecA膜蛋白在25℃条件下用终浓度1 mM的IPTG诱导pET16b-Tb wecA/ER2566生长16 h。用超声方法破碎诱导后的细菌,提取细胞膜组分,用去污剂n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（n-Dodecyl-β-D-maltoside, DDM）溶解膜蛋白,将样品分别进行Dot blot,SDS-PAGE和Western blot分析。从pET16b-Tb wecA/ER2566的膜组分中能够检测到表达的WecA蛋白。用镍-组氨酸亲和层析法对带有N-末端组氨酸标签的WecA融合蛋白进行纯化,对纯化的WecA蛋白进行酶活性分析。2.建立了WecA酶活性分析方法（1）WecA酶活性检测:TLC法将底物C50-P和UDP-GlcNAc与纯化的WecA蛋白共同孵育,用氯仿/甲醇/氨水抽提有机相并真空干燥。用氯仿溶解样品后,将样品点在TLC板上进行层析,用磷钼酸对脂类进行显色,通过底物C50-P的消耗量和产物C50-P-P-GlcNAc的生成量来确定WecA酶活性。结果显示,用TLC法检测到了纯化的WecA蛋白具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶活性。（2）WecA酶活性检测:HPLC法将反应底物C50-P和UDP-GlcNAc和纯化的WecA蛋白共同孵育,用氯仿/甲醇/氨水萃取反应液,对水相进行HPLC检测,通过底物UDP-GlcNAc的减少量来确定WecA酶活性。结果显示,纯化的WecA蛋白与底物共同孵育后,底物UDP-GlcNAc有了明显的消耗,峰面积减小了约20%,由此进一步证明了所纯化的WecA蛋白具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶活性。3.尝试了WecA膜蛋白表达的其它方法（1）以pCold-Tb wecA为表达载体,低温诱导WecA膜蛋白在E. coli MV501菌株中的表达用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切pET16b-Tb wecA质粒,将Tb wecA基因克隆到pColdⅡ载体的NdeⅠ和BamHⅠ位点,构建出pCold-Tb wecA表达质粒。所构建的pCold-Tb wecA载体具有冷休克基因cspA启动子,便于在低温诱导表达蛋白,提高蛋白的可溶性和稳定性。此外该载体还具有N-末端组氨酸标签序列,表达WecA融合蛋白,便于蛋白的检测和纯化。在15℃条件下用终浓度1 mM的IPTG诱导WecA蛋白的表达。将上清组分、沉淀组分和膜蛋白进行SDS-PAGE及Western blot分析。结果表明,从pCold-Tb wecA/MV501的膜蛋白组分中能够检测到表达的WecA蛋白。（2）N端截短的WecA膜蛋白在大肠杆菌中的表达根据wecA全基因序列设计特异性引物,用PCR方法获得删除N末端1个跨膜区的基因Tb wecA del1及删除N末端3个跨膜区的基因Tb wecA del2,构建pMD18-Tb wecA del1和pMD18-Tb wecA del2克隆载体,并对阳性重组质粒进行核苷酸序列测定。用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切pMD18-Tb wecA del1和pMD18-Tb wecA del2克隆质粒,分别将Tb wecA del1和Tb wecA del2基因片段连接到pET29b载体,构建pET29b-Tb wecA del1和pET29b-Tb wecA del2表达质粒。截短的WecA蛋白（WecA del1和WecA del2）的C-末端与组氨酸标签融合,便于截短蛋白的检测和纯化。分别将pET29b-Tb wecA del1和pET29b-Tb wecA del2表达载体转化至E. coli BL21（DE3）、CD41（DE3）和ER2566菌株中,在37℃条件下用终浓度为1 mM的IPTG诱导WecA截短蛋白的表达。将上清、沉淀组分和膜蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析,在各组分中没有检测到WecA截短蛋白的表达,说明N末端的氨基酸序列可能对维持WecA蛋白的结构十分重要。（3）WecA膜蛋白的体外表达分别将pET16b-wecA,pET29b-wecA del1及pET29b-wecA del2质粒作为模板加入到体外表达系统（MembraneMax Protein Expression Kit）中,经过30 min的起始反应和2 h的补充反应后,将反应产物进行SDS-PAGE和Western blot分析以及WecA酶活性鉴定,但尚未获得足够量有活性的WecA全长或截短膜蛋白。对WecA膜蛋白的体外表达条件需进一步优化。结论:1.以pET16b-Tb wecA质粒为表达载体,在E. coli ER2566细胞中表达了WecA膜蛋白,并对WecA蛋白进行了纯化。2.建立了WecA酶活性分析方法,分别利用TLC和HPLC检测到了纯化的WecA蛋白具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶活性,从酶学角度进一步证实了结核分枝杆菌Rv1302基因就是N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶（WecA）的编码基因wecA,同时也为进一步研究该酶的催化特性奠定了基础。3.尝试了表达WecA膜蛋白的其它方法:用pCold-Tb wecA表达载体在E. coli MV501菌株中表达了WecA膜蛋白,但表达量没有提高;构建了pET29b-Tb wecA del1和pET29b-Tb wecA del2两个表达载体,并分别使用三种E. coli表达菌株尝试表达WecA截短蛋白,但尚未获得WecA截短蛋白,说明N末端氨基酸序列对WecA蛋白有重要作用;初步尝试了体外表达WecA膜蛋白的方法。
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