论文摘要
许多研究表明应激是心血管疾病的重要诱因和病因,应激所致心肌细胞的凋亡是心血管疾病发生的重要细胞学基础之一,线粒体在应激致心肌细胞凋亡发生过程中具有重要作用。尽管对细胞凋亡线粒体通路的诱导因素和效应分子的研究已经比较深入,但是应激致心肌细胞凋亡线粒体通路启动的分子机制一直没有得到充分阐明。本课题组前期对细胞凋亡相关重要蛋白质的研究中发现应激诱导心肌细胞凋亡时TR3由胞核向线粒体移位。有研究发现,肿瘤细胞在凋亡诱导剂作用下,核内TR3向线粒体的移位可导致细胞凋亡。因此,我们推测,应激心肌细胞中TR3的线粒体移位可能是细胞凋亡通路活化的重要分子机制。为了对此进行科学求证,开展本研究工作,以期阐明TR3在应激致心肌细胞凋亡线粒体机制中的作用及其分子基础,为揭示应激性心血管疾病发生的生物学基础提供科学依据。一、TR3移位线粒体在应激致心肌细胞凋亡过程中的作用应用慢性束缚应激方法建立了应激致心肌细胞凋亡的整体动物模型,用GC干预的方法建立了应激致心肌细胞凋亡的离体细胞模型。蛋白质免疫印迹和细胞免疫荧光技术检测应激心肌细胞中TR3表达和亚细胞定位的改变,发现应激大鼠心肌细胞中TR3的表达水平没有明显改变,但在线粒体中的含量明细增多。分别采用核输出抑制剂LMB和磷酸化通路阻断剂PKA Inhibitor调控应激心肌细胞中TR3向线粒体的移位,观察其对应激心肌细胞凋亡的影响。结果发现,TR3移位线粒体与心肌细胞凋亡密切相关,阻断TR3的线粒体移位可有效抑制应激心肌细胞的凋亡。这表明应激过程中TR3的线粒体移位是心肌细胞凋亡的重要分子机制。二、TR3在应激心肌细胞线粒体中相关功能蛋白质的发现建立了蛋白质非变性凝胶电泳技术,结合蛋白质免疫印迹方法发现了应激心肌细胞线粒体中3个TR3相关的蛋白质复合体。质谱鉴定结果显示除TR3外,3个蛋白质复合体中还分别包括,波形蛋白;乙酰-CoA合成酶、柠檬酸合成酶、乳酸脱氢酶、丁脂酰辅酶A脱氢酶;苹果酸脱氢酶、热休克蛋白65（HSP65）、葡萄糖调节蛋白75（GRP75）。在上述发现的8个线粒体蛋白质中,6个蛋白质与线粒体能量代谢密切相关,基于此,本研究进一步分析了应激心肌细胞中线粒体能量代谢水平。结果显示,应激可导致心肌细胞线粒体ATP合成酶活性和ATP含量显著降低。这一结果从线粒体能量代谢水平的角度对应激心肌细胞中TR3相关线粒体蛋白质的发现提供了进一步的佐证。使用免疫共沉淀的方法对应激心肌细胞中TR3相关的线粒体重要功能蛋白质GRP75与TR3的相互作用进行了进一步验证。结果发现,在应激心肌细胞线粒体中二者存在相互作用,而在非应激心肌细胞线粒体中则没有发现二者相互作用。采用GST融合蛋白沉降技术（GST Pull Down）对二者体外相互作用进行研究,结果也未发现TR3和GRP75在体外存在直接相互作用。上述结果表明,应激心肌细胞线粒体中TR3和GRP75的相互作用是心肌细胞应激反应过程中一种重要的分子效应,二者相互作用可能对应激心肌细胞的生物学反应具有重要意义。三、GRP75在TR3介导应激心肌细胞凋亡过程中的作用构建了TR3和GRP75的真核表达载体和siRNA载体,并在H9c2细胞（来源于胚胎大鼠的心肌细胞系）中对相关载体的基因表达调控作用进行了验证,结果表明所构建的上述载体对相关基因的表达具有明确的调控作用。利用上述载体调控细胞中TR3和GRP75的表达水平,观察其对细胞凋亡的影响作用。结果显示,TR3的表达升高可导致应激细胞线粒体膜电位明显下降,Caspase级联反应活化、细胞凋亡率显著增加;GRP75表达水平的升高可抑制TR3的这种促凋亡的作用,而GRP75表达水平降低时,TR3对细胞凋亡的诱导作用显著增强。这表明GRP75在TR3介导应激心肌细胞凋亡过程中具有重要调控作用。心肌细胞线粒体上GRP75的正常生理功能主要是调控线粒体膜电位和能量代谢。进一步对TR3和GRP75在上述功能调控过程中的作用进行研究。结果发现应激条件下TR3高表达可导致H9c2细胞线粒体能量代谢和线粒体膜电位下降。上调GRP75的表达水平可减缓应激心肌细胞内TR3介导的细胞能量代谢紊乱和线粒体膜电位下降,抑制GRP75的表达水平可明显增强应激心肌细胞中TR3介导的线粒体能量代谢紊乱和线粒体膜电位下降。这些结果表明,应激条件下TR3介导细胞凋亡主要是通过阻抑GRP75对线粒体能量代谢和线粒体膜电位的调节作用而实现的。线粒体GRP75是TR3诱导应激心肌细胞凋亡的关键作用靶点。综上所述,心肌细胞应激过程中,TR3由胞核向线粒体移位。其可通过与线粒体结构、功能相关蛋白质的相互作用调控细胞的功能和生命。其中GRP75是TR3启动应激心肌细胞凋亡线粒体机制的重要调控靶点。GRP75对于维护线粒体正常能量代谢和线粒体膜电位具有重要的调节功能,TR3通过阻抑GRP75的上述功能进而促进应激心肌细胞凋亡的发生。应激心肌细胞中TR3-GRP75-线粒体调控途径的发现为寻找应激心肌损伤防治药物靶点提供了重要的科学启示。
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