大肠杆菌DNA错配修复机理研究

大肠杆菌DNA错配修复机理研究

论文摘要

在校正DNA复制错误的生化途径中,错配修复通路(MMR)起至关重要的作用。依靠移除DNA新生链上的错误合成碱基,错配修复将DNA复制的忠实性提高了几个数量级。错配修复系统的缺失会造成突变表型和易于发生癌症。此外,错配修复也影响减数分裂和有丝分裂重组,DNA损伤信号传递,凋亡和某些细胞种类特异性的过程,比如淋巴细胞高频突变,类别转换和重复序列的扩增。错配修复和DNA复制是紧密相关的。本研究主要以大肠杆菌错配修复系统为研究对象,针对大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ是如何协同错配修复蛋白进行错修复的生化过程进行了探索和研究。我们首次发现大肠杆菌错配修复蛋白MutL能够和DNA聚合酶Ⅲ中组成Clamp loader的三个亚基δ,δ′,和γ相互作用,并且亲和常数显示它们之间的相互作用很稳定。这个结果暗示了MutL可能在招募DNA聚合酶Ⅲ亚基参与错配修复切除后在合成的过程中起到了重要作用;此外,MutL和Clamp loader亚基的相互作用受到ATP的调控;缺失突变试验还表明MutL的N端或者C端都能够和Clamp loader的三个亚基δ,δ′,和γ相互作用。这些新发现的相互作用,加上前人的研究,让我们绘制出大肠杆菌错配修复系统和DNA聚合酶Ⅲ亚基之间的联系网络。除了发现这些新的相互作用,我们还研究了MutS和DNA聚合酶Ⅲ亚基之一的βclamp之间相互作用的生物学功能。我们发现位于MutS的N端和C端的两个βclamp结合位点有着不同的生物学功能:C端的强结合位点让两个蛋白结合在一起,而N端的弱结合位点调控MutS,错配DNA和βclamp之间的关系。我们的实验证据表明,MutS C端βclamp结合位点可能是引导MutS跟随复制叉移动来寻找错配,而MutS N端βclamp结合位点着能够促使MutS结合错配之后和βclamp结合位点解离。这些发现对于理解MutS是如何找到错配并且开始启动错配修复的机制提供了线索。此外,我们还研究了错配修复系统之外的蛋白结合错配的特征以及错配修复关键蛋白MutL对不同类型DNA的结合,表明了除了已知的错配修复系统之外可能还存在着别的补充途径。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 英文缩写表
  • 第一章 DNA错配修复机理研究进展
  • 1.1 简介
  • 1.1.1 DNA复制、基因突变和错配修复
  • 1.1.2 错配修复的生物学意义
  • 1.2 大肠杆菌中甲基化介导的错配修复系统
  • 1.2.1 大肠杆菌错配修复系统的组成
  • 1.2.2 大肠杆菌甲基化介导的错配修复
  • 1.3 真核生物的错配修复
  • 1.3.1 真核生物MutS和MutL的功能
  • 1.3.2 真核生物中错配修复途径的其它成分
  • 1.3.3 由纯化蛋白组建的真核生物中错配引起的切除系统
  • 1.4 MutS蛋白和MutL蛋白的结构
  • 1.5 错配修复过程中DNA上不同位置分子事件的偶联
  • 1.6 错配修复的其它生物学功能
  • 1.6.1 错配修复蛋白在DNA烷基化损伤中的作用
  • 1.6.2 错配修复蛋白在抗体分化中的作用
  • 1.7 本课题的研究意义和目的
  • 第二章 BIAcore技术及其在生命科学中的应用
  • 2.1 BIAcore技术简介
  • 2.2 蛋白质组学
  • 2.3 信号转导
  • 2.4 新药开发
  • 2.5.前景展望
  • 第三章 大肠杆菌错配修复蛋白MutL和DNA聚合酶Ⅲ clamp loader的相互作用
  • 3.1 前言
  • 3.2 材料与方法
  • 3.2.1 实验材料
  • 3.2.2 实验方法
  • 3.3 结果与分析
  • 3.3.1 holA,holB,dnaX,mutlsbp等基因的克隆和蛋白的表达纯化
  • 3.3.2 Clamp loader的组装
  • 3.3.3 MutL系列缺失突变体的构建和纯化
  • 3.3.4 MutL-SBP能够弥补mutl基因缺陷的大肠杆菌
  • 3.3.5 Far western分析MutL和Clamp loader之间的相互作用
  • 3.3.6 SPR确定和量化了新发现的蛋白质间的相互作用
  • 3.3.7 MutL和δ,γ和clamp loader之间的相互作用受到ATP的调控
  • 3.3.8 不同的MutL缺失突变体和聚合酶clamp loader亚基之间的相互作用
  • 3.4 讨论
  • 第四章 大肠杆菌MutS,MutL蛋白和β clamp相互作用的分子机制和功能研究
  • 4.1 前言
  • 4.2 材料与方法
  • 4.2.1 实验材料
  • 4.2.2 实验方法
  • 4.3 结果与分析
  • 4.3.1 大肠杆菌MutS蛋白突变体的构建
  • 4.3.2 从大肠杆菌基因组中扩增β clamp
  • 4.3.3 β-clamp和β-clampSBP的表达纯化
  • 4.3.4 MutS突变体蛋白的表达纯化
  • 4.3.5 原子力显微镜观察β clamp
  • 4.3.6 β clamp阻止MutS结合错配
  • 4.3.7 β-clamp和MutS之间的相互作用受到ATP的调控
  • 4.3.8 β-clamp不能结合MutS-DNA符合物
  • 4.3.9 MutS和β-clamp相互作用的Motif和关键氨基酸
  • 4.3.10 所有的MutS突变体都和野生型一样能和MutL相互作用
  • 4.3.11 MutSC △812-815能够完全互补MutS缺陷的大肠杆菌,但是在2-AP的存在显示出了突变型特征
  • N△15-19不能恢复大肠杆菌mutS缺陷菌株的错配修复功能,表现为缺陷型'>4.3.12 MutSN△15-19不能恢复大肠杆菌mutS缺陷菌株的错配修复功能,表现为缺陷型
  • N △15-19的圆二色谱分析'>4.3.13 MutSN△15-19的圆二色谱分析
  • N △15-19结合错配DNA能力和ATPase活性分析'>4.3.14 MutSN△15-19结合错配DNA能力和ATPase活性分析
  • 4.4.15 MutL能够直接与β-clamp相互作用
  • 4.3.16 β-clamp能够和MutL相互作用并且阻止MutL去结合ssDNA
  • 4.4 讨论
  • 第五章 大肠杆菌错配修复蛋白MutL结合DNA以及不同DNA错配结合蛋白的初步研究
  • 5.1 前言
  • 5.2 材料与方法
  • 5.2.1 实验材料
  • 5.2.2 实验方法
  • 5.3 结果与分析
  • 5.3.1 菌体PCR扩增大肠杆菌mutM基因
  • 5.3.2 人源p53基因的扩增
  • 5.3.3 人源p53的表达和纯化
  • 5.3.4 不同MutL突变体蛋白的纯化
  • 5.3.5.p53与不同错配DNA的结合
  • 5.3.6 MutM与不同错配DNA的结合
  • 5.3.7 MutL与3'overhang DNA,5'overhang DNA以及ssDNA的结合
  • 5.4 讨论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录
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