高寒藏药材体细胞杂种核/质基因组特征及其成分分析

论文摘要

植物远缘体细胞杂交难以再生植株成为限制其发展的瓶颈,本实验之前,科间体细胞杂交再生植株仅有几例。利用体细胞杂交技术转移并提高中药材有效成分的研究刚刚开始,仅见胡萝卜与西洋参体细胞杂种有效成分含量测定的报道。远缘科间体细胞杂交中双亲核、质基因组的组成特征及其相互作用的研究尚未见报道。 本实验以高寒藏药材湿生扁蕾原生质体为供体,经380uW/cm2的紫外线照射0sec、30sec、1min后,与柴胡（受体）在PEG诱导下进行融合,暗培养2个月获得大量对称及不对称再生克隆,转至增殖培养基上继续生长,并诱导分化。对各再生克隆及再生植株进行形态学、染色体、同工酶、5SrDNA及RAPD分析,证明它们为体细胞杂种,杂种细胞系核基因组组成以柴胡为主,并有重组发生。用线粒体和叶绿体特异性探针coxI和rbcL与杂种总基因组进行杂交,结果表明,体细胞杂种线粒体和叶绿体基因组随机分离,多数克隆具有双亲特征带。通过HPLC对杂种克隆及双亲进行药效成分分析,结果表明,杂种克隆Ⅰ-21、Ⅱ-21、Ⅲ-4中含有较低含量的齐墩果酸及獐牙菜苦甙,湿生扁蕾含有齐墩果酸及獐牙菜苦甙,而柴胡仅含有齐墩果酸,进一步对相应克隆进行GC-MS计算机联用分析,发现杂种中含有大部分柴胡（受体）的特征性物质,少量的湿生扁蕾特征性物质及非双亲物质（新物质）。 以高寒藏药材川西獐牙菜原生质体为供体,经380uW/cm2的紫外线照射0sec、30sec、1min后,与胡萝卜（受体）在PEG诱导下进行融合,暗培养45天获得大量30sec及1min的再生克隆。对融合产物进行形态学、染色体、同工酶、5SrDNA及RAPD分析鉴定获得了不对称体细胞杂种细胞系。对上述杂种细胞系核基因组分析表明杂种核基因组组成以胡萝卜为主,并有重组发生。用叶绿体特异性引物进行SSR分析结果表明胡萝卜与川西獐牙菜不对称体细胞杂种叶绿体基因组为双亲型,部分克隆出现新带或丢失一条亲本的特征带。 本论文开展了藏药材与远缘科间植物的不对称体细胞杂交研究,建立了体细胞杂交再生植株的实验体系;研究了亲缘关系、UV剂量对杂种植株再生及染色体消减和片段化的影响;探讨了远缘科间体细胞杂交中双亲核、质基因组的组成特征。分析了湿生扁蕾有效成分及其化学成分代谢谱在不同体细胞杂种中的差异性。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 文献综述
• 1. 植物体细胞杂交研究发展
• 1.1 融合方法的发展
• 1.2 融合方式的发展—对称融合与不对称融合
• 1.3 原生质体的来源与制备
• 1.4 体细胞杂种鉴定
• 2. 目标性状转移
• 3. 植物体细胞杂交与核质及胞质基因组研究
• 3.1 植物体细胞杂交后代核质及胞质基因组多样性
• 3.2 体细胞杂种核质基因组遗传学
• 3.3 体细胞杂种胞质基因研究
• 3.4 植物胞质基因组控制的性状
• 4. 药用植物组织培养和体细胞杂交研究进展
• 4.1 植物组织培养及其在中草药研究中的运用
• 4.2 高寒藏药材组织培养和体细胞杂交研究进展
• 4.3 高寒藏药材——川西獐牙菜及湿生扁蕾主要有效成分简介
• 4.4 药效成分含量检测与分析方法
• 5. 研究背景及立题意义
• 材料与方法
• 1. 原生质体的游离与制备
• 2. UV处理供体原生质体
• 3. 双亲原生质体的融合和培养
• 4. 再生愈伤组织的鉴定
• 4.1 染色体分析
• 4.2 同工酶分析
• 4.3 RAPD分析
• 4.4 5S rDNA间隔序列分析
• 4.5 胞质基因 SSR分析
• 4.6 胞质基因 RFLP分析
• 5. HPLC测定药效含量
• 6. GC-MS
• 6.1 样品制备与超声提取
• 6.2 分析条件
• 6.3 仪器
• 实验结果（一） 柴胡与藏药材湿生扁蕾科间体细胞杂种植株再生及及其化学成分的鉴定
• 1. 融合产物的生长发育
• 2. 融合再生愈伤组织的鉴定
• 2.1 再生克隆的同工酶分析
• 2.2 染色体分析
• 2.3 5SrDNA间隔序列分析
• 2.4 RAPD分析
• 2.5 供受体核基因组对杂种核基因组的贡献
• 2.6 体细胞杂种核基因组组成与紫外线照射的关系
• 3. 杂种线粒体基因组分析
• 3.1 质粒探针的回收
• 3.2 线粒体基因组组成
• 3.3 叶绿体基因组组成
• 3.4 杂种克隆核基因组与叶绿体基因组在继代培养过程中的变化
• 3.5 融合再生植株杂种性质的鉴定
• 4. HPLC测定部分杂种克隆及柴胡、湿生扁蕾药效成分
• 5. GC-MS分析
• 实验结果（二） 胡萝卜与川西獐牙菜不对称体细胞杂种核、质基因组研究
• 1 胡萝卜与川西獐牙菜原生质体融合培养和植株发育
• 2 融合产物杂种性质的鉴定
• 2.1 表型比较
• 2.2 细胞学鉴定
• 2.3 5SrDNA间隔序列分析
• 2.3 RAPD分析
• 2.4 体细胞杂种叶绿体基因组组成
• 讨论
• 1. 科间植物体细胞杂种染色体消减与植株再生
• 2. UV照射在体细胞融合中的效应
• 3. 杂种中核基因组互作
• 4. 胞质基因组成及存在方式
• 5. 体细胞杂种的核基因组互作
• 6. 利用体细胞杂交技术实现藏药材药效成分的转移
• 参考文献
• 在读期间发表的文章及获奖情况
• 致谢