东北马鹿鹿茸上皮组织cDNA文库构建及胰岛素样生长因子（IGFs）基因的克隆

论文摘要

本研究以马鹿鹿茸上皮组织为材料,利用SV Total RNA试剂盒分离抽提总RNA,并运用SMART技术构建了马鹿鹿茸上皮组织全长cDNA文库。试验结果表明:（1）总RNA电泳中18S、28S两条带清晰明显无降解,总RNA质量好、纯度高,符合建库要求。（2）经鉴定原始文库滴度为1.28×106 pfu/ml,经筛选文库重组率达到85%以上,插入片断平均长度约为1.5 kb,扩增后文库滴度为2.4×108pfu/ml。说明构建的文库质量合格。参考野猪Sus scrofa（DQ784687）、原牛Bos Taurus（BTILGF A）、盘羊Ovis aries（NM001009774）、人Homo sapiens（NM000618）、小鼠Mus musculus（AF440694）等物种的IGF1基因组DNA序列,设计兼并性引物,用PCR方法从文库中扩增出一条长约500bp的DNA片段,测序表明马鹿鹿茸上皮组织IGF1基因CDS区序列长469bp,与野猪Sus scrofa、原牛Bos Taurus、盘羊Ovis aries、人Homo sapiens、小鼠Musmusculus的IGF1基因CDS区核苷酸序列同源性依次为97.8%、97.6%、93.1%、91.8%和87.2%;而氨基酸序列同源性依次为97.4%、96.8%、94.8%、94.2%和93.0%。参考野猪Sus scrofa（NM.213883）、原牛Bos Taurus（BTILGF2）、盘羊Ovis aries（SHPIGFIIA）、小鼠Mus musculus（MMU71085）、人Homo sapiens（NM001007139）、大鼠Rat（NM031511）等物种的IGF2基因组DNA序列,设计兼并性引物,用PCR方法从文库中扩增出一条长约600bp的DNA片段,测序表明马鹿鹿茸上皮组织IGF2基因CDS区长540bp,与野猪Sus scrofa、原牛Bos Taurus、盘羊Ovis aries、小鼠Musmusculus、人Homo sapiens和大鼠Rat IGF2基因的核苷酸序列同源性分别是86.5%、95.8%、95.0%、85.8%、82.3%、82.7%;上述研究结果一方面为揭开鹿茸的生长发育机制提供实验数据,另一方面为马鹿优良新品种分子标记选育和分子设计奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 研究对象
• 1.1.1 东北马鹿
• 1.1.2 我国对鹿茸的应用
• 1.1.3 鹿茸的化学成分以及药理作用
• 1.1.4 分子标记辅助育种
• 1.2 cDNA文库的构建策略及其进展
• 1.2.1 cDNA文库的应用
• 1.2.2 cDNA文库的不同类型
• 1.2.3 cDNA文库的不同构建方法及其优缺点
• 1.3 IGF1和IGF2基因
• 1.3.1 IGF简介
• 1.3.2 IGFl对骨细胞的作用
• 1.3.3 IGF2对生长发育的作用
• 1.3.4 克隆胰岛素样生长因子意义
• 1.4 目前cDNA文库构建技术发展趋势
• 2 马鹿鹿茸上皮组织cDNA文库构建及IGFs基因克隆
• 2.1 材料和实验药品
• 2.1.1 材料与试剂盒
• 2.1.2 实验药品配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 总RNA提取
• 2.2.2 cDNA第一链的合成
• 2.2.3 LD-PCR扩增cDNA
• 2.2.4 cDNA纯化
• 2.2.5 Sfi I酶切
• 2.2.6 用Chroma SPIN-400将cDNA过柱
• 2.2.7 cDNA文库建立
• 2.2.8 cDNA文库插入片断长度长度
• 2.2.9 IGF1克隆及测序
• 2.2.10 IGF2克隆及测序
• 3 结果与分析
• 3.1 总RNA的提取
• 3.2 双链cDNA合成和鉴定
• 3.3 cDNA片段的酶切和分级分离
• 3.4 原始文库质量鉴定
• 3.5 扩增文库质量鉴定
• 3.6 IGFl基因产物的克隆
• 3.7 测序结果
• 3.8 马鹿鹿茸上皮IGF1基因序列的比较分析
• 3.8.1 分子系统进化树
• 3.9 IGF2基因产物产物的克隆
• 3.10 测序结果
• 3.11 马鹿鹿茸上皮IGF2基因序列的比较分析
• 3.11.1 分子系统进化树
• 4 讨论
• 4.1 总RNA的纯度及完整性
• 4.2 全长cDNA文库的构建
• 4.3 鹿茸中间的IGFs基因的克隆及测序
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢