甘油脱水酶基因的克隆表达及分子改性

论文摘要

1，3-丙二醇（1，3-propanediol，1，3-PD）是一种重要的化工原料，采用生物法制取1，3-PD的开发与研究在国内外受到越来越广泛的关注。甘油脱水酶是生物法代谢生产1，3-PD的关键酶和限速酶，因此对其的研究显得尤为重要。该文首先克隆表达了甘油脱水酶及其相关酶的基因，研究了它们的酶学性质，并从理性和非理性角度对甘油脱水酶进行了分子改造，利用同源建模构建了相关酶的三维结构，并利用三维结构信息分析探讨了三维结构和酶学性质之间的关系。主要取得结果如下：1甘油脱水酶及其相关基因的克隆表达、酶学性质及结构研究（1）克隆并高效表达了弗氏柠檬酸菌的甘油脱水酶基因dhaBCE，纯化后测定了该酶的酶学性质。并通过同源建模获得了该重组酶的三维结构信息，预测了该酶的活性中心。（2）克隆并高效表达了克雷伯氏菌的甘油脱水酶基因gldABC，纯化后测定了该酶的酶学性质。并通过同源建模获得了该重组酶的三维结构信息，预测了该酶的活性中心。（3）从甘油富集菌的宏基因组中克隆表达了一个基因，并确定为甘油脱水酶基因。通过同源建模获得了该酶的三维结构信息，活性中心的与底物结合的6个氨基酸残基中的Asp336位（位于大亚基）变为了Gly336，底物与周围氨基酸氨基之间的氢键与其它的甘油脱水酶相比均发生了变化，初步分析可能是造成此甘油脱水酶没有活力的原因。（4）克隆并高效表达了弗氏柠檬酸菌的1，3．丙二醇氧化还原酶基因dhaT。纯化后测定了该酶的酶学性质。并通过同源建模构建了其三维结构并分析了结构特征。（5）通过over-lap PCR方法将甘油脱水酶基因dhaBCE和1，3-丙二醇氧化还原酶dhaT基因首尾相连，构成一个多顺反子，实现了在大肠杆菌中的协同表达，液相和气相色谱均显示有1，3-PD的产生和积累。（6）克隆并协同表达了弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶的激活因子基因dhaF和dhaG，纯化后研究其激活性质表明：此激活因子不但可以激活本身的甘油脱水酶，而且还可以交叉激活克雷伯氏菌和产气荚膜梭菌两个不同种属的甘油脱水酶，但并不能激活巴氏梭菌的甘油脱水酶；并通过同源建模方法构建了该激活因子的三维结构。（7）克隆并协同表达了克雷伯氏菌甘油脱水酶的激活因子基因gdrA和gdrB。纯酶的激活实验表明，此激活因子不但可以激活本身的甘油脱水酶，而且还可以交叉激活弗氏柠檬酸菌和产气荚膜梭菌两个不同种属的甘油脱水酶，但并不能激活巴氏梭菌的甘油脱水酶；并通过同源建模方法构建了该激活因子的三维结构。2甘油脱水酶高通量筛选体系采用双层指示平板，根据直观的颜色反应，建立了一套甘油脱水酶的高通量的筛选方法，筛选在非正常条件下（酸性、碱性和高温等）的突变酶，该方法可以大大降低背景的影响，简捷、高效。3甘油脱水酶的定向进化（1）以五种不同种属来源的甘油脱水酶基因为材料，利用DNaseI和内切酶结合法进行familiy shuffling，虽然没有筛选到酶学性质得到改善的突变子，但序列分析显示基因间发生了强烈的重组，实验为family shuffling的继续开展奠定了基础。（2）通过error-prone PCR方法对克雷伯氏菌的甘油脱水酶基因进行随机突变研究，得到了稳定性明显改善的两个突变酶，GDHtKP5-2和GDHtKP6-1，其中GDHtKP6-1在pH6.0条件下的半衰期是野生酶的16倍，并且45℃和50℃时的稳定性得到了明显的提高，45℃时的半衰期大约是野生酶的6倍。通过同源建模初步分析了野生型和突变型GDHt在三维结构上的差异；并通过能量计算，探讨了它们酶学性质差异的原因。4甘油脱水酶的理性设计（1）通过能量的理性设计，对来自于弗氏柠檬酸菌、克雷伯氏菌和宏基因组的甘油脱水酶的大、中-小亚基进行了异源亚基之间的杂合改组，结果表明：部分杂合酶具有活力，其酶学性质也得到明显改善。杂合酶GDHt（KU）使来源于宏基因组的本没有活力的甘油脱水酶获得了活力，虽然比活力比较低，但其热稳定性得到了非常明显的提高；另外，杂合酶GDHt（CK）和GDHt（KC）在酸性条件下的稳定性均得到了明显的提高。最后，通过同源建模初步分析了野生型和杂合型甘油脱水酶在三维结构上的差异，并探讨了它们酶学性质差异的原因。（2）通过PoPMuSiC理性设计，对克雷伯氏菌甘油脱水酶进行了定点突变，结果显示：突变体的酸碱稳定性有较明显的改善，突变体GDHtKP525在酸碱条件下的半衰期提高了约1.5～2倍；GDHtKP60在碱性条件下的稳定性得到了提高。通过同源建模初步分析了野生型和突变型甘油脱水酶在三维结构上的差异，并探讨了它们酶学性质差异的原因。（3）结合ProSa理性设计，对弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶进行饱和突变研究，结果显示：突变体的酶学性质有一定程度的改善，突变体283-2-1和283.3-3的Km值均有一定程度的升高，突变体283-2-1的Km值明显变大，约是野生酶的2～3倍。突变体297-6-12的Km值明显变小，约是野生酶1／3～5；突变体297-6-11的Km值虽有升高但不明显，而Vmax值提高比较明显，约是野生酶的2～3倍，其中对甘油的Vmax值提高了约3.3倍。而α222位点的突变体的酶学性质均没有得到改善。通过同源建模初步分析了野生型和突变型甘油脱水酶在三维结构上的差异，并探讨了它们酶学性质差异的原因。据我们所知，有关甘油脱水酶理性和非理性分子改性的系统研究，在国内外均无报道，我们是首次开辟了这一领域的研究。本研究为国内外深入了解甘油脱水酶性质与结构的关系以及生物法高效生产1，3-PD奠定了良好的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 1,3-丙二醇研究概况
• 1.2 甘油脱水酶的研究概况
• 1.2.1 甘油脱水酶的生产菌
• 1.2.2 甘油脱水酶的作用
• 1.2.3 甘油脱水酶基因及dha调节子
• 1.2.4 不同来源的甘油脱水酶序列比对
• 12'>1.2.5 CoB₁₂
• 1.2.6 甘油脱水酶的激活蛋白及失活和激活机制
• 1.2.7 甘油脱水酶的晶体结构
• 1.3 微生物酶分子进化的研究情况
• 1.3.1 酶的分子改性策略
• 1.3.1.1 易错PCR技术（error-prone PCR）
• 1.3.1.2 定点突变和饱和突变
• 1.3.1.3 DNA改组（DNA shuffling）
• 1.3.1.3.1 经典的DNA shuffling
• 1.3.1.3.2 交错延伸（stagger extension process,StEP）
• 1.3.1.3.3 非同源性序列间的DNA改组
• 1.3.1.3.4 Family shuffling
• 1.3.1.3.5 限制性内切酶family shuffling
• 1.3.1.3.6 ss-DNA shuffling
• 1.3.1.3.7 Genome shuffling
• 1.3.1.4 微生物酶DNA shuffling的研究动态
• 1.3.1.4.1 提高微生物酶的活性
• 1.3.1.4.2 改变微生物酶对底物的专一性
• 1.3.1.4.3 提高微生物酶的稳定性
• 1.3.1.4.4 增加微生物酶的抗性
• 1.3.1.4.5 增加微生物酶的pH耐受性
• 1.3.1.5 外显子重组（Exon Shuffling）
• 1.3.1.6 杂合酶（hybrid enzyme）
• 1.3.1.7 定向进化、理性设计和计算机辅助设计的结合
• 1.3.2 酶定向进化的筛选方法
• 1.3.2.1 表形筛选方法
• 1.3.2.2 微板筛选
• 1.3.2.3 噬菌体展示技术（Phage display）
• 1.3.3 微生物酶定向进化及理性设计的应用前景
• 1.4 课题的来源及研究的目的意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株及质粒
• 2.1.2 酶与试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 基本实验方法
• 2.2.1 弗氏柠檬酸菌、克雷伯氏菌、巴氏梭菌及产气荚膜梭菌的培养
• 2.2.2 甘油富集菌的采样及培养
• 2.2.2.1 采样
• 2.2.2.2 甘油菌的富集培养
• 2.2.3 菌株保存
• 2.2.4 弗氏柠檬酸菌、克雷伯氏菌、巴氏梭菌及产气荚膜梭菌基因组总DNA的提取
• 2.2.5 甘油富集菌宏基因组DNA的提取
• 2.2.5.1 宏基因组DNA的粗提
• 2.2.5.2 宏基因组DNA的纯化
• 2.2.6 弗氏柠檬酸菌及克雷伯氏菌甘油脱水酶基因引物设计、扩增及表达载体构建
• 2.2.6.1 PCR引物的设计
• 2.2.6.2 PCR扩增
• 2.2.6.3 表达载体构建
• 2.2.7 弗氏柠檬酸菌1,3-丙二醇氧化还原酶基因引物设计、PCR扩增及表达载体构建
• 2.2.7.1 PCR引物的设计
• 2.2.7.2 PCR扩增
• 2.2.7.3 表达载体构建
• 2.2.8 弗氏柠檬酸菌和克雷伯氏菌甘油脱水酶激活因子基因引物设计、PCR扩增及表达载体构建
• 2.2.8.1 PCR引物的设计
• 2.2.8.2 PCR扩增
• 2.2.8.3 表达载体构建
• 2.2.9 宏基因组甘油脱水酶基因的PCR扩增及载体构建
• 2.2.9.1 PCR扩增
• 2.2.9.2 验证及测序
• 2.2.9.3 表达载体构建
• 2.2.10 大肠杆菌感受态的制备
• 2.2.10.1 化学法大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.10.2 电穿孔大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.11 质粒DNA的大量制备
• 2.2.12 质粒DNA的小量制备
• 2.2.13 DNA的酶切与连接
• 2.2.14 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
• 2.2.14.1 化学转化大肠杆菌感受态细胞
• 2.2.14.2 电转化大肠杆菌JM109感受态细胞
• 2.2.15 阳性克隆的筛选和酶切验证
• 2.2.16 重组子质粒PCR验证及活力验证
• 2.2.17 外源片段在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.2.18 甘油脱水酶、1,3-丙二醇氧化还原酶及激活因子粗酶液的制备
• 2.2.18.1 生化法破胞
• 2.2.18.2 超声波法破胞
• 2.2.18.3 包涵体的检测
• 2.2.19 表达产物的变性SDS-PAGE电泳
• 2.2.20 表达产物的非变性胶蛋白质电泳
• 2.2.21 表达产物表达量分析
• 2.2.22 酶的纯化
• 2.2.22.1 金属亲和层析Ni-NTA介质的再生和活化
• 2.2.22.2 GDHt的纯化
• 2.2.22.3 PDOR的纯化
• 2.2.22.4 GDHt激活因子的纯化
• 2.2.23 蛋白含量测定
• 2.2.24 甘油脱水酶活力的测定
• 2.2.24.1 GDHt活力测定原理
• 2.2.24.2 测定的具体步骤
• 2.2.24.3 酶活力的定义
• 2.2.24.4 酶活力计算
• 2.2.25 甘油脱水酶酶学性质测定
• 2.2.25.1 pH对GDHt活力的影响
• 2.2.25.2 温度对GDHt活力的影响
• m及V_max测定'>2.2.25.3 GDHt的K_m及V_max测定
• 2.2.25.4 GDHt的pH稳定性实验
• 2.2.25.5 GDHt的热稳定性实验
• 2.2.26 1,3-丙二醇氧化还原酶活力的测定
• 2.2.26.1 测定原理
• 2.2.26.2 具体步骤
• 2.2.26.3 酶活力的定义
• 2.2.26.4 PDOR活力的计算方法
• 2.2.27 1,3-丙二醇氧化还原酶酶学性质测定
• 2.2.27.1 pH值对1,3-丙二醇氧化还原酶活力的影响
• 2.2.27.2 温度对1,3-丙二醇氧化还原酶的影响
• m及V_max测定'>2.2.27.3 1,3-丙二醇氧化还原酶的K_m及V_max测定
• 2.2.28 甘油脱水酶激活因子的激活试验
• 2.2.28.1 GDHt失活原理和激活原理
• 2.2.28.2 GDHt的失活方法
• 2.2.28.3 GDHt的激活方法
• 2.3 甘油脱水酶高通量筛选体系的建立
• 2.3.1 反应机理
• 2.3.2 反应溶液及指示培养基
• 2.3.2 高通量筛选具体步骤
• 2.4 三维结构同源建模方法
• 2.4.1 比对分析氨基酸的同源性
• 2.4.2 构建三维结构同源模型
• 2.4.3 分析整理模型
• 2.5 定向进化（irrational directed evolution）相关实验方法
• 2.5.1 甘油脱水酶基因的改组（family shuffling）
• 2.5.1.1 Family shuffling模板基因的获得
• 2.5.1.1.1 GDHt全长基因的获得
• 2.5.1.1.2 GDHt大亚基基因的获得
• 2.5.1.2 Family shuffling模板基因的片段化
• 2.5.1.2.1 DNase I片段化法
• 2.5.1.2.2 内切酶片段化法
• 2.5.1.3 GDHt基因片段的再组装（无引物PCR）
• 2.5.1.4 GDHt全长基因及大亚基基因的扩增（有引物PCR）
• 2.5.1.5 弗氏柠檬酸菌中小亚基基因表达载体的构建
• 2.5.1.6 Family shuffling突变文库的构建
• 2.5.1.7 Family shuffling突变文库的筛选
• 2.5.1.8 改组酶的酶学性质测定
• 2.5.1.9 改组酶的基因测序及序列分析
• 2.5.2 克雷伯氏菌甘油脱水酶基因易错PCR（error-prone PCR）相关方法
• 2.5.2.1 Error-prone PCR扩增模板的甲基化
• 2.5.2.2 Error-prone PCR引物
• 2.5.2.3 Error-prone PCR反应体系
• 2.5.2.4 Error-prone PCR突变文库的构建
• 2.5.2.5 Error-prone PCR突变文库的筛选
• 2.5.2.6 突变酶的酶学性质测定
• 2.5.2.7 突变酶的基因测序及序列分析
• 2.5.2.8 野生及突变酶的3D结构建模及三维结构分析
• 2.6 酶的理性设计进化（rational directed evolution）相关实验方法
• 2.6.1 甘油脱水酶的基因杂合改组（gene swapping）
• 2.6.1.1 扩增模板的甲基化
• 2.6.1.2 GDHt大亚基及中小亚基基因的获得
• 2.6.1.3 甲基化质粒模板的消除
• 2.6.1.4 理性设计和三种GDHt大亚基基因之间的杂合交换及表达载体构建
• 2.6.1.5 Gene swapping重组子的筛选
• 2.6.1.6 杂合酶的酶学性质测定
• 2.6.1.7 杂合酶的序列分析
• 2.6.1.8 野生酶及杂合酶的3D结构建模及三维结构分析
• 2.6.2 克雷伯氏菌甘油脱水酶基因的定点突变（site mutagenesis）
• 2.6.2.1 定点突变方法
• 2.6.2.1.1 重叠PCR法（Over-lap PCR）
• 2.6.2.1.2 反向PCR法
• 2.6.2.2 突变点的选择
• 2.6.2.3 克雷伯氏菌GDHt基因定点突变PCR引物设计
• 2.6.2.4 定点突变PCR扩增
• 2.6.2.4.1 位点α-Y525E的突变扩增
• 2.6.2.4.2 位点α-F60E的突变扩增
• 2.6.2.5 GDHt基因定点突变载体的构建及转化
• 2.6.2.5.1 位点α-Y525E载体的构建及转化
• 2.6.2.5.2 位点α-F60E载体的构建及转化
• 2.6.2.6 GDHt基因定点突变重组子的筛选验证
• 2.6.2.7 突变酶的纯化及酶学性质测定
• 2.6.2.8 野生酶及突变酶的3D结构建模及三维结构分析
• 2.6.3 弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶的饱和突变
• 2.6.3.1 饱和突变方法—一步反向PCR法
• 2.6.3.2 饱和突变点的选择
• 2.6.3.3 弗氏柠檬酸菌GDHt基因饱和突变PCR引物设计
• 2.6.3.4 饱和突变的PCR扩增
• 2.6.3.5 GDHt基因饱和突变文库的构建
• 2.6.3.6 GDHt基因饱和突变文库的筛选
• 2.6.3.7 饱和突变酶的酶学性质测定
• 2.6.3.8 饱和突变酶的基因测序及序列分析
• 2.6.3.9 野生及饱和突变酶的3D结构建模及三维结构分析
• 第三章 甘油脱水酶及其相关基因的克隆表达、酶的纯化、酶学性质及结构研究
• 3.1 弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶基因的克隆表达、序列分析、酶学性质及结构研究
• 3.1.1 结果与分析
• 3.1.1.1 弗氏柠檬酸菌GDHt基因的克隆及表达载体的构建
• 3.1.1.2 C.freundii GDHt的序列分析
• 3.1.1.3 dhaBCE基因表达产物的蛋白质电泳分析
• 3.1.1.4 弗氏柠檬酸菌GDHt的纯化及比活力测定
• 3.1.1.5 酶学性质
• 3.1.1.6 弗氏柠檬酸菌GDHt三维结构分析
• 3.1.2 讨论
• 3.1.2.1 同源性
• 3.1.2.2 表达与纯化
• 3.1.2.3 酶学性质
• 3.2 克雷伯氏菌甘油脱水酶基因的克隆表达、序列分析、酶学性质及结构研究
• 3.2.1 结果与分析
• 3.2.1.1 克雷伯氏菌GDHt基因的克隆及表达载体的构建
• 3.2.1.2 克雷伯氏菌GDHt序列分析
• 3.2.1.3 gldABC基因表达产物的蛋白质电泳分析
• 3.2.1.4 克雷伯氏菌GDHt的纯化及比活力测定
• 3.2.1.5 酶学性质
• 3.2.1.6 克雷伯氏菌GDHt三维结构分析
• 3.2.2 讨论
• 3.3 宏基因组甘油脱水酶基因的克隆与表达、鉴定及结构研究
• 3.3.1 结果与分析
• 3.3.1.1 宏基因组DNA的提取
• 3.3.1.2 宏基因组的GDHt基因的克隆及表达载体的构建
• 3.3.1.3 宏基因组的GDHt的序列分析
• 3.3.1.4 udhaBCE基因表达产物的SDS-PAGE分析
• 3.3.1.5 宏基因组的GDHt的纯化及活力测定
• 3.3.1.6 宏基因组GDHt的三维结构同源建模
• 3.3.2 讨论
• 3.4 弗氏柠檬酸菌1,3-丙二醇氧化还原酶基因的克隆和表达、序列分析、酶学性质及结构研究
• 3.4.1 结果与分析
• 3.4.1.1 dhaT 基因的克隆及表达载体的构建
• 3.4.1.2 C.freundii PDOR序列分析
• 3.4.1.3 外源基因表达及重组酶的纯化及比活力测定
• 3.4.1.4 PDOR的酶学性质
• 3.4.1.5 弗氏柠檬酸菌1,3-丙二醇氧化还原酶三维结构同源建模
• 3.4.2 讨论
• 3.5 弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶及1,3-丙二醇氧化还原酶基因的协同表达及产物测定
• 3.5.1 结果与分析
• 3.5.1.1 弗氏柠檬酸菌GDHt基因及1,3-丙二醇氧化还原酶基因的连接及表达载体的构建
• 3.5.1.2 重组子的筛选
• 3.5.1.3 产物的色谱分析
• 3.5.2 讨论
• 3.6 弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶激活因子基因的克隆、协同表达和酶的纯化及激活实验
• 3.6.1 结果与分析
• 3.6.1.1 弗氏柠檬酸菌GDHt激活因子基因的克隆及表达载体的构建
• 3.6.1.2 弗氏柠檬酸菌GDHt激活因子基因序列分析
• 3.6.1.3 外源基因表达及重组酶的纯化
• 3.6.1.4 GDHt的氧失活
• 3.6.1.5 GDHt的激活实验
• 3.6.1.6 弗氏柠檬酸菌DhaFG三维结构同源建模
• 3.6.2 讨论
• 3.7 克雷伯氏菌甘油脱水酶激活因子基因的克隆表达和酶的纯化及激活实验
• 3.7.1 结果与分析
• 3.7.1.1 克雷伯氏菌GDHt激活因子基因的克隆及表达载体的构建
• 3.7.1.2 克雷伯氏菌GDHt激活因子基因序列分析
• 3.7.1.3 外源基因表达及重组酶的纯化
• 3.7.1.4 GDHt的氧失活
• 3.7.1.5 GDHt的激活及交叉激活实验
• 3.7.1.6 克雷伯氏菌GdrAB三维结构同源建模
• 3.7.2 讨论
• 第四章 甘油脱水酶的改造、纯化和酶学性质及结构研究
• 4.1 甘油脱水酶高通量的筛选方法
• 4.1.1 高通量筛选方法
• 4.1.2 讨论
• 4.2 甘油脱水酶的非理性设计
• 4.2.1 五种不同种属的甘油脱水酶的改组（family shuffling）
• 4.2.1.1 结果与分析
• 4.2.1.1.1 五种GDHt全长及大亚基基因的获得
• 4.2.1.1.2 Family shuffling模板的片段化
• 4.2.1.1.3 Family shuffling的无引物和有引物PCR及表达载体构建
• 4.2.1.1.4 突变文库的筛选和性质测定
• 4.2.1.1.5 突变酶的序列分析
• 4.2.1.2 讨论
• 4.2.2 克雷伯氏菌甘油脱水酶基因的易错PCR（error-prone PCR）
• 4.2.2.1 结果与分析
• 4.2.2.1.1 克雷伯氏菌GDHt基因的error-prone PCR突变文库的构建及筛选
• 4.2.2.1.2 突变酶的纯化
• 4.2.2.1.3 突变酶的序列分析
• 4.2.2.1.4 重组野生酶及突变酶的酶学性质
• 4.2.2.1.5 突变酶三维结构分析
• 4.2.2.2 讨论
• 4.3 甘油脱水酶的理性设计（rational design）
• 4.3.1 甘油脱水酶基因间的杂合改组（gene swapping）
• 4.3.1.1 结果与分析
• 4.3.1.1.1 GDHt及其大、中-小亚基基因的克隆、杂合及表达载体的构建
• 4.3.1.1.2 外源基因表达及重组杂合酶的纯化
• 4.3.1.1.3 重组GDHt的序列分析
• 4.3.1.1.4 重组GHDt及杂合酶的酶学性质
• 4.3.1.1.5 野生型酶及杂合酶三维结构分析
• 4.3.1.2 讨论
• 4.3.2 克雷伯氏菌甘油脱水酶基因的定点突变（site mutagenesis）
• 4.3.2.1 结果与分析
• 4.3.2.1.1 克雷伯氏菌GDHt基因突变位点
• 4.3.2.1.2 克雷伯氏菌GDHt基因定点突变PCR
• 4.3.2.1.3 突变子的验证及突变酶的纯化
• 4.3.2.1.4 野生酶及突变酶的酶学性质
• 4.3.2.1.5 突变酶三维结构分析
• 4.3.2.2 讨论
• 4.3.3 弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶基因的饱和突变（saturation mutagenesis）
• 4.3.3.1 结果与分析
• 4.3.3.1.1 弗氏柠檬酸菌GDHt基因饱和突变位点
• 4.3.3.1.2 弗氏柠檬酸菌GDHt基因饱和突变PCR
• 4.3.3.1.3 突变子筛选验证及测序
• 4.3.3.1.4 突变型GDHt的纯化
• 4.3.3.1.5 野生酶及突变酶的酶学性质
• 4.3.3.1.6 突变酶三维结构分析
• 4.3.3.2 讨论
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.1.1 甘油脱水酶基因及其相关基因的克隆表达、酶学性质及结构研究
• 5.1.2 甘油脱水酶高通量筛选体系
• 5.1.3 甘油脱水酶的非理性设计
• 5.1.4 甘油脱水酶的理性设计
• 5.2 问题与展望
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢