家蚕抗浓核病毒（中国镇江株）分子标记及相关基因研究

论文摘要

家蚕是重要的经济昆虫,也是鳞翅目的模式昆虫。家蚕浓核病毒是蚕业生产上危害比较严重的一类病毒。目前为止在家蚕中共发现了3种浓核病毒,中国镇江株与DNV-2型相似,但是在血清学上存在差异。家蚕对BmDNV-1型的抗性由隐性单基因nsd-1和显性单基因Nid-1控制,它们之间相互独立。而家蚕对BmDNV-Z型的抗性由位于15号染色体的另一个隐性基因nsd-z控制。本论文从DNA入手利用RAPD技术筛选与抗性基因连锁的分子标记,并转换成SCAR标记,为分子标记辅助育种育种奠定基础。同时采用近等基因系结合荧光差异显示技术研究了家蚕对浓核病毒的抗性相关基因,其主要研究结论如下: 1.在抗DNV的品种秋丰d、高感品种华八35及其近等基因系BC6中,通过495个RAPD随机引物在各个品种的DNA混合样本中进行PCR扩增,获得了一个与家蚕抗DNV基因相关的分子标记S366。对这个标记进行了克隆、测序,并且根据序列设计特异引物转换成SCAR标记。在多个敏感性和抗性品种中进行验证,证明此分子标记真实可靠。通过生物信息学对测序片段进行分析,发现该片段序列与黄嘌呤脱氢酶基因有91%的同源性。黄嘌呤脱氢酶在先天性免疫系统中有很多细胞保护功能,暗示着黄嘌呤脱氢酶基因可能与家蚕抗DNV有某种联系。 2.通过荧光差异显示技术,在抗DNV的品种秋丰d、高感品种华八35及其近等基因系BC6中获得了与抗性相关的20多个特异条带。经过荧光定量PCR验证确认了一个与抗性相关的特异片段,5’-RACE获得了一个1096bp的全长序列。生物信息学分析后发现该基因是一

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.1 昆虫免疫
• 1.1.1 体液免疫
• 1.1.1.1 抗菌肽
• 1.1.1.2 溶菌酶
• 1.1.1.3 酚氧化酶
• 1.1.2 细胞免疫
• 1.1.2.1 细胞免疫中的血细胞类型
• 1.1.2.2 血细胞介导的效应器反应
• 1.2 浓核病毒研究
• 1.2.1 浓核病毒的分类
• 1.2.2 浓核病毒的理化特征
• 1.2.3 浓核病毒的宿主域及病理学特征
• 1.2.4 DNV基因组特征
• 1.2.5 浓核病毒的复制与表达
• 1.3 家蚕浓核病毒研究
• 1.4 家蚕对BMDNV抗性研究进展
• 1.5.分子标记研究
• 1.5.1 主要分子标记技术介绍
• 1.5.1.1 限制性片段长度多态性标记
• 1.5.1.2 随机扩增多态性标记
• 1.5.1.3 限制片段选择扩增
• 1.5.1.4 简单重复序列
• 1.5.1.5 简单序列重复间扩增
• 1.5.1.6 SCAR标记
• 1.5.1.7 几种主要分子标记技术的比较
• 1.5.2 分子标记在家蚕中的应用
• 1.6 荧光差异显示技术
• 1.6.1 差异显示技术在家蚕上的应用
• 1.6.2 差异显示技术的缺点及改进
• 1.7 荧光定量PCR
• 1.7.1 非特异性双链DNA嵌入染料（SYBR Green Ⅰ）
• 1.7.2 TagMan探针
• 1.7.3 杂交探针
• 1.7.4 荧光定量PCR的应用
• 1.8 立题的目的意义
• 1.9 主要研究内容和实验方案：
• 第二章 仪器设备及药品试剂
• 2.1 主要实验仪器设备
• 2.2 主要实验试剂和药品
• 第三章 实验方法
• 3.1 家蚕近等基因系构建
• 3.1.1 添食病毒的处理
• 3.1.2 材料饲养
• 3.2 家蚕基因组DNA提取
• 3.3 家蚕基因组DNA随机扩增多态性PCR（RAPD）
• 3.4 低熔点琼脂糖胶回收DNA片段
• 3.5 家蚕中肠MRNA提取
• 3.6 荧光差异显示（FDD RT-PCR）
• 3.7 cDNA第二链的PCR扩增反应
• 3.8 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.9 差显片段的回收和扩增
• 3.10 目的片段克隆
• 3.10.1 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 3.10.2 连接
• 3.10.3 转化：
• 3.10.4 质粒DNA的小量制备
• 3.10.5 DNA限制性内切酶消化
• 3.10.6 克隆鉴定
• 3.11 序列测定
• 3.12 RAPD特异片段的特异引物验证
• 3.13 5’-RACE
• 3.14 荧光定量PCR
• 3.15 生物信息学软件及网站
• 第四章 RAPD结果与分析
• 4.1 家蚕基因组DNA提取
• 4.2 RAPD筛选结果
• 4.3 克隆测序
• 4.4 RAPD分子标记转换成SCAR标记及其验证
• 4.5 特异分子标记得快速检测
• 4.6 分子标记的序列分析
• 4.7 讨论
• 第五章 FDD RT-PCR结果与分析
• 5.1 总RNA提取结果
• 5.2 MRNA荧光差异片段的获得、克隆和测序
• 5.3 REAL-TIME PCR验证特异条带
• 5.4 5′-RACE结果
• 5.4.1 全长cDNA的获得
• 5.4.2 序列分析
• 5.4.3 基因结构分析
• 5.5 讨论
• 第六章 家蚕Tpn Ⅰ基因的克隆与分析
• 6.1 全长cDNA
• 6.2 序列分析
• 6.3 基因结构分析
• 6.4 讨论
• 第七章 结论
• 致谢
• 硕士期间发表的论文和参加的课题
• 参考文献