论文摘要
目的:构建人巨细胞病毒（HCMV）IE1蛋白与增强型绿色荧光蛋白EGFP融合蛋白真核细胞表达载体pEGFP-C1/IE1,将其转染入THP-1巨噬细胞,初步探讨GFP-HCMV IE1融合蛋白瞬时高表达对THP-1巨噬细胞分泌细胞因子活性及其凋亡的影响,为进一步研究IE1蛋白在HCMV致病机制中的作用奠定实验基础。方法:（1）用HindⅢ和BamHⅠ双酶切pNEB193/IE1质粒,将IE1基因片段亚克隆入pcDNA3.1（+）载体,双酶切鉴定及测序分析; SalⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pcDNA3.1（+）/IE1,然后将目的基因亚克隆入pEGFP-C1,构建真核表达载体pEGFP-C1/IE1。（2）将真核表达载体pEGFP-C1/IE1与pEGFP-C1分别转染THP-1巨噬细胞,实验分3组:巨噬细胞空白对照组（Control组）;pEGFP-C1转染巨噬细胞组（GFP组）;pEGFP-C1/IE1转染巨噬细胞组（GFP-IE1组）。转染48h后,通过Western-blotting和倒置荧光显微镜检测GFP-HCMVIE1融合蛋白或GFP的表达与定位。（3）利用ELISA分别检测12h、24h、48h各组细胞培养上清中TNF-α和IL-1β的含量;采用RT-PCR检测其mRNA的表达;收集巨噬细胞经PI染色后流式细胞术（FCM）检测其凋亡率。（4）利用统计软件SPSS13.0分析实验数据。结果:（1） IE1基因亚克隆至pcDNA3.1（+）载体上后,经双酶切及测序分析,所克隆的目的片段与GenBank上公布的HCMV IE1基因序列完全一致,然后将目的片段亚克隆入pEGFP-C1中,双酶切结果显示构建了真核表达载体pEGFP-C1/IE1,且GFP-IE1融合蛋白在THP-1巨噬细胞内瞬时表达并定位于细胞核,GFP在整个细胞中均匀表达。Western-blotting结果表明在THP-1巨噬细胞中表达了分子量约101.4kD的融合蛋白。（2）转染12h时,GFP-IE1组培养上清中TNF-α、IL-1β含量明显升高,随着时间的递增,2种细胞因子分泌量呈上升趋势,与空白对照组或GFP组比较差异有显著性（P<0.01）。GFP瞬时表达对2种细胞因子的分泌影响差异无显著性（P>0.05）。GFP-IE1组TNF-α和IL-1βmRNA表达水平均增加。（3）转染后48h,GFP-IE1组巨噬细胞凋亡率明显升高,与空白对照组或GFP组比较差异有显著性（P<0.01）,而GFP组巨噬细胞凋亡率与对照组比较差异无显著性（P>0.05）。结论:（1）成功构建了真核表达载体pEGFP-C1/IE1 ,且能在THP-1巨噬细胞中表达GFP-HCMV IE1融合蛋白并定位于细胞核。（2） GFP-HCMV IE1融合蛋白瞬时高表达上调THP-1巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β。（3） GFP-HCMV IE1融合蛋白瞬时高表达诱导THP-1巨噬细胞凋亡。
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