沉香内生真菌的初步研究

论文摘要

内生真菌（Endophytic fungi）是一大类未被充分研究的真菌。近年来的研究表明,几乎所有植物中都存在内生真菌,他们主要生长在植物的根、茎、叶等器官的表皮下的组织当中。它泛指那些生活在健康的植物体内不引起任何病害症状的所有真菌,植物内生真菌长期生活在稳定的植物微生态系统中,和宿主建立了共生或半共生关系。研究表明已分离出的大多数植物内生真菌能够产生与其宿主相同或相似的活性成分。白木香树的茎干在刀砍、虫蛀、病腐后被真菌感染,木质部的薄壁细胞中储存的物质产生一系列化学变化,最后形成树脂,即为沉香。为了找出含有树脂的木材,必须砍倒树干才能找出含有沉香树脂的个体,导致大量白木香树遭人砍伐,严重影响了白木香族群的生存。同时,沉香的高价也导致了白木香在多个沉香产地国被非法砍伐及贸易。因此,从沉香木块中分离沉香内生真菌研究人工结香具有重要的意义。本论文通过优化内生真菌的分离条件,从沉香木块中分离纯化出9株沉香内生真菌,然后通过苄基丙酮耐受性、人工结香材料分析等方法筛选出4株内生真菌具有促进结香作用;对该4株内生真菌进行分子生物学种属鉴定、人工结香条件实验和红褐肉座菌摇瓶发酵实验。实验结果概括如下:1、沉香内生真菌分离条件优化实验中,采用次氯酸钠（5%有效氯）作为表面消毒剂处理效果较好,选择次氯酸钠（5%有效氯）消毒合适的时间为4min,最适分离培养温度是26℃。共分离纯化出9株沉香内生真菌,经初步鉴定分属2亚门、5目、5科、5属。2、对沉香挥发油提取方法进行方法学研究,选择索氏提取无水乙醚回流法结合GC-MS分析沉香挥发油成分组成。3、沉香内生真菌的筛选实验中,先后通过苄基丙酮耐受性筛选、人工结香样品变色部分的宽度和燃烧香味筛选,最后筛选出Aq-2、Aq-3、Aq-5b、Aq-7等4株内生真菌。4、沉香内生真菌的分子生物学种属鉴定,鉴定结果为:Aq-2为蒂腐色二孢（Botryosphaeria rhodina）,Aq-3为红褐肉座菌（Hypocrea jecorina）,Aq-5b里氏木霉（Trichoderma reesei）,Aq-7为康氏木霉（Trichoderma koningii）。5、对4株沉香内生真菌蒂腐色二孢、红褐肉座菌、里氏木霉、康氏木霉按照封口方式、打孔位置、接菌方式、结香时间等方案进行人工结香条件研究。最适结香条件:采用棉塞和木塞作为封口方式;选择树干自基部50～100cm之间的区域作为结香位置;采用蒂腐色二孢菌株单菌结香和褐肉座菌、里氏木霉、康氏木霉3株木霉属内生真菌混菌结香,其次是里氏木霉、康氏木霉混合人工结香等作为人工结香方式;适当延长接菌时间,可以得到品质好的沉香。6、红褐肉座菌摇瓶发酵液和菌体内含物GC-MS的检测实验,在发酵液成分中未发现苄基、呋喃基等基团的成分存在,菌体内含物中检测出苯吡喃类化合物,属于沉香复杂成分中的一种,但是该化合物的含量非常少,而且成分也比较单一,采用微生物发酵产沉香物质的可行性受到限制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 植物内生真菌的研究进展
• 1.1.1 内生真菌的定义及研究历程
• 1.1.2 内生真菌的广泛性和生物多样性
• 1.1.3 内生真菌的生态学
• 1.1.4 内生真菌次生代谢产物的多样性
• 1.1.5 内生真菌的分离培养方法的研究
• 1.1.6 内生真菌的分类鉴定
• 1.1.7 存在的问题
• 1.2 沉香的概述
• 1.2.1 本草考证
• 1.2.2 沉香的应用
• 1.2.3 沉香的采收及人工结香
• 1.2.4 沉香化学成分
• 1.2.5 沉香的鉴别方法
• 1.3 主要研究内容和意义
• 1.3.1 研究内容
• 1.3.2 研究意义
• 第2章 沉香内生真菌的分离纯化及形态鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物样品
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 技术路线
• 2.2.2 沉香木块表面消毒方法的优化
• 2.2.3 沉香木块表面次氯酸钠消毒时间的优化
• 2.2.4 沉香木内生真菌分离培养温度的优化
• 2.2.5 沉香木内生真菌菌种的纯化
• 2.2.6 沉香木内生真菌菌株的形态学初步鉴定
• 2.2.7 沉香内生真菌菌种的斜面保藏
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 沉香木块表面消毒方法的优化
• 2.3.2 沉香木块表面次氯酸钠消毒时间的优化
• 2.3.3 沉香木内生真菌分离培养温度的优化
• 2.3.4 沉香木内生真菌菌株的形态学初步鉴定
• 2.4 小结
• 第3章 产香菌株的筛选及分子生物学鉴定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验样品
• 3.1.2 菌种
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 主要试剂
• 3.1.5 仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 沉香挥发油提取方法比较
• 3.2.2 沉香内生真菌菌株的活化
• 3.2.3 沉香内生真菌各菌株对节基丙酮的耐受性筛选
• 3.2.4 沉香内生真菌人工结香优势菌种的筛选
• 3.2.5 促进白木香树产香内生真菌菌株的分子生物学鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 沉香挥发油提取方法比较
• 3.3.2 沉香内生真菌各菌株对节基丙酮的耐受性筛选
• 3.3.3 沉香内生真菌人工结香优势菌种的筛选
• 3.3.4 促进白木香树产香内生真菌菌株的分子生物学鉴定
• 3.4 小结
• 第4章 产香菌株人工结香条件的研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 产香菌种和白木香树
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 产香内生真菌菌种液的制备
• 4.2.2 人工结香
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 人工结香封口方式对结香的影响
• 4.3.2 人工结香打孔位置对结香的影响
• 4.3.3 人工结香混菌种液对结香的影响
• 4.3.4 人工结香结香时间对结香的影响
• 4.4 小结
• 第5章 红褐肉座菌（Hypocrea jecorina）摇瓶发酵产沉香类物质的研究
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 产香菌种和白木香木块
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 主要试剂
• 5.1.4 主要仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 斜面培养
• 5.2.2 液体种子培养
• 5.2.3 发酵培养
• 5.2.4 发酵液沉香类成分的提取
• 5.2.5 菌丝体内沉香类成分的提取
• 5.2.6 沉香类成分的测定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 发酵培养
• 5.3.2 发酵液沉香类成分的测定
• 5.3.3 菌丝体内沉香类成分的测定
• 5.4 小结
• 第6章 结论与展望
• 6.1 沉香内生真菌的分离
• 6.2 沉香内生真菌的形态学初步鉴定
• 6.3 沉香挥发油提取方法比较
• 6.4 产香内生真菌的筛选
• 6.5 产香菌种的分子生物学鉴定
• 6.6 利用产香菌种人工结香条件的研究
• 6.7 红褐肉座菌摇瓶发酵产沉香类物质研究
• 6.8 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间的研究成果