拟南芥中胚胎败育相关基因AtED1（embryo defective 1）功能的初步研究

论文摘要

成熟胚是植株个体的雏形,胚胎发育是形成植株的基础。多年来,科学家们对影响植物胚胎发生的基因展开了广泛的研究,其中的一些基因与胚胎早期形态建成相关。在鉴定这些基因的过程中发现了至少250个胚缺陷基因（embryo-defective genes, EMBs）为胚正常发育所不可或缺。这些基因的功能各异,分别参与细胞生长、代谢、转运、转录和翻译等过程。为了研究影响胚胎发育过程基因的功能,本研究从拟南芥T-DNA插入突变体库中分离到了一个种荚中有1/4胚胎败育的突变体,命名为ed1（ embryo defective 1）,ED1功能缺失引起胚胎在早期球形胚阶段停止发育,最终败育。此外,ed1突变体除了胚胎分裂异常,胚乳也有异常,胚乳核数目减少,体积增大,胚乳核分裂中停滞于中期。用染色体步行的方法我们扩增T-DNA插入的侧翼序列发现T-DNA插入在At4g24900的第4个内含子上。ED1编码一个功能未知的蛋白,氨基酸序列分析表明它含有类似C2H2的结构域。在植物中是保守的,由于ed1是胚胎致死的突变体,我们无法得到纯合突变体植株,所以该基因突变对植物体生长发育的影响仍不清楚。我们对这一未知功能的蛋白进行表达模式分析,发现其主要表达于幼嫩的叶片、种荚和成熟植株叶柄,花柄,茎等微管组织部位;在胚珠中的胚胎和胚乳均有广泛表达,这一结果与ED1在胚胎和胚乳中的表达与其参与胚胎和胚乳发育的功能相吻合。在对其转录水平进行分析时发现其至少有九种不同的转录本。用GFP融合蛋白做亚细胞定位发现ED1基因定位在细胞核。最后用酵母双杂交的方法筛选互作的蛋白,初步筛选到了14个蛋白,其中有ACT12、MYB7、MPK18、ubiquitin 10等蛋白,这一结果还有待验证。以上这些结果表明,拟南芥ED1基因突变导致胚胎和胚乳发育异常进而造成胚胎败育,说明ED1基因在拟南芥胚胎发育的早期发育过程中起着重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 模式生物拟南芥
• 1.1.1 普通生物学特性
• 1.1.2 遗传学特性
• 1.2 被子植物胚胎发生
• 1.2.1 胚胎发育
• 1.2.2 胚乳发育
• 1.3 胚胎败育相关基因研究进展
• 1.3.1 胚胎发育相关基因
• 1.3.2 胚乳发育相关基因
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验样品
• 2.1.2 菌种
• 2.1.3 载体
• 2.1.4 工具酶和修饰酶
• 2.1.5 分子量标准
• 2.1.6 测序及引物合成
• 2.1.7 试剂盒
• 2.1.8 化学试剂
• 2.1.9 序列分析软件及网站
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 拟南芥的栽培
• 2.2.2 简易法提取拟南芥基因组DNA
• 2.2.3 扩增T-DNA 侧翼序列
• 2.2.4 拟南芥突变体的鉴定
• 2.2.5 RT-PCR
• 2.2.6 胚和胚乳发育观察
• 2.2.7 全长互补载体的构建
• 2.2.8 GUS 融合载体的构建
• 2.2.9 农杆菌LBA 4404 电击感受态细胞的制备和农杆菌转化
• 2.2.10 拟南芥转化（Floral Dipping 法）
• 2.2.11 转基因植株的筛选和鉴定
• 2.2.12 转化子的GUS 染色
• 2.2.13 GFP 载体的构建及原生质体转化
• 2.2.14 酵母表达载体构建及转化
• 第3章 结果与分析
• 3.1 突变体ed1 的分离
• 3.2 T-DNA 插入位点边界序列扩增及突变体基因型与表现型的连锁分析
• 3.2.1 T-DNA 插入位点边界序列扩增
• 3.2.2 突变体基因型与表现型的连锁分析
• 3.3 ed1 突变体中雌雄配子的发育正常
• 3.4 ED1 蛋白序列分析
• 3.5 ED1 基因互补实验
• 3.6 ed1 突变体胚胎和胚乳发育异常
• 3.7 ED1 存在多个转录本
• 3.8 ED1 表达模式分析
• 3.9 亚细胞定位
• 3.10 转录激活活性验证和酵母双杂筛库
• 第4章 讨论
• 4.1 AT4G24900 基因突变导致胚胎败育
• 4.2 AtED1 基因有多个转录本
• 4.3 AtED1 基因作用机制分析
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表论文情况
• 致谢