论文摘要
志贺（氏）菌毒素（Shiga toxin）是主要由痢疾志贺菌（Shigella dysenteriae）产生的一种重要的致病毒力因子,由具有酶活性的A亚基和结合作用的B亚基两部分构成。志贺（氏）菌毒素的受体为鞘糖脂Gb3（globotriaosylceramide）,其广泛存在于哺乳动物细胞膜表面。志贺（氏）菌毒素经过复杂的胞吞途径进入细胞内部杀死细胞。志贺（氏）菌毒素与细胞表面的Gb3受体结合后,经过逆转运方式进入内质网,再由内质网最终到达细胞质中。在细胞质之中,志贺（氏）菌毒素的酶活部分使28S rRNA失活,从而抑制蛋白的合成。但是,目前的研究对于毒素在胞内转运的机制还有很多不清楚的地方。本论文旨在研究志贺（氏）菌毒素B亚基N端的作用,通过基因克隆的方法对B亚基N端进行修饰,并对修饰后B亚基的胞内运输进行研究。本论文首先以pGlyc-KDEL质粒为模板扩增出STxB的基因序列,并将其连接到带有GST的pGEX-4T-1骨架载体上,构建原核表达载体GST-STxB-pGEX-4T-1,并在大肠杆菌DH5α中通过IPTG诱导表达,然后利用谷胱苷肽Sepharose 4B凝胶亲和层析对重组的蛋白进行纯化。纯化的蛋白采用SDS-PAGE和Western blot进行检测,并且用高效液相Bio-sil SEC 250凝胶柱对重组的蛋白进行分析,以确定其多聚体结构。我们对重组纯化后的GST-STxB蛋白进行了胞内运输的研究。首先将N端修饰的蛋白GST-STxB和未做修饰的蛋白STxB（对照）,分别与Hela细胞在4℃培养30min和37℃培养120min,然后利用间接免疫荧光法在荧光显微镜下观察蛋白的位置,结构表明N端修饰的GST-STxB蛋白的胞内运输受到严重影响,说明志贺（氏）菌毒素B亚基N端的结构,对其胞内运输起着重要的作用。流式细胞仪检测发现,GST-STxB蛋白与细胞表面受体Gb3结合率的下降是导致转运障碍的直接原因。
论文目录
中文摘要英文摘要第一章 文献综述一、鞘糖脂G63（globotriaosylceramide）的研究进展（一） 鞘糖脂的结构（二） 鞘糖脂的生物学作用（三） 鞘糖脂G63（globotriaosylceramide）的结构及生物活性（四） 鞘糖脂G63（globotriaosylceramide）在细胞内的运输二、Shiga toxin 的结构与活性（一） Shiga toxin 的分子结构（二） Shiga toxin 的生物活性三、志贺（氏）菌毒素（Shiga toxin）的细胞内运输（一） Shiga toxin 的内吞（二） Shiga toxin 由内含体到高尔基体的转运（三） Shiga toxin 由高尔基体到内质网的转运（四） Shiga toxin 酶活部分到达细胞质的转运四、目前的研究概况五、本文的研究内容与意义第二章 实验材料和方法一、实验材料（一） 细胞及其培养试剂（二） 原始质粒（三） 其他试剂与药品（四） 实验仪器二、实验方法（一） 质粒的构建（二） 质粒的大量制备（三） GST-STxB 蛋白在大肠杆菌中的诱导表达（四） SDS-PAGE 与 Western blotting（五） GST-STxB 蛋白的大量制备（六） GST-STxB 蛋白的纯化（七） GST-STxB 蛋白的 HPLC 分析（八） 哺乳动物细胞培养（九） GST-STxB 蛋白的胞内运输（十） GST-STxB 蛋白与Hela 细胞表面G63 受体结合量的流式细胞检测第三章 结果与分析一、质粒构建及其验证（一） 目的基因片段的扩增（二） 目的基因片段与载体的连接（三） GST-STxB-pGEX-4T-1 质粒的酶切验证二、GST-STxB 蛋白的诱导表达（一） SDS-PAGE 分析（二） 蛋白的纯化（三） Western blotting（四） 蛋白的除盐、浓缩三、GST-STxB 蛋白的 HPLC 分析四、GST-STxB 蛋白的胞内运输五、GST-STxB 蛋白与Hela 细胞表面G63 受体结合量的流式细胞检测第四章 讨论一、GST-STxB 目的片段的克隆二、GST-STxB 蛋白的表达与纯化 三、GST-STxB 蛋白的结构分析四、GST-STxB 蛋白的胞内运输第五章 结论参考文献致谢
相关论文文献
- [1].睾丸生殖细胞肿瘤及睾丸原位癌中鞘糖脂GB3的表达及意义[J]. 诊断病理学杂志 2013(03)
- [2].Gb3的测定在法布莱病诊断及治疗中的意义[J]. 职业与健康 2012(10)
标签：鞘糖脂论文; 志贺氏菌毒素论文; 胞内运输论文; 表达载体论文;
