论文摘要
结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是常见的消化系统恶性肿瘤。全球范围,结直肠癌发病率和致死率均排在第三位。在中国,它是仅次于胃癌和食管癌的第三大消化系统肿瘤。结直肠癌早期症状不明显,发现时往往已是晚期,有些已经发生转移。临床上最主要的治疗方法是手术切除,虽然手术技术日新月异,但是患者的5年生存率并未发生明显改观。现今,肿瘤耐药、远端转移、复发、副作用等问题依然困扰着广大医学工作者。因此,深入研究结直肠癌的发生和发展机制、寻找更有效的诊断、治疗和预后手段,对于攻克肿瘤、造福人类健康具有重要意义。微小RNAs（microRNAs,miRNAs）是一类小片段非编码RNAs。20多年来,尤其是近10年来,它一直是肿瘤研究领域的热点。miRNAs的作用广泛,通过与靶基因mRNA的3’-非翻译区（3’-UTR）互补结合,抑制靶基因的翻译从而参与多种生物学功能,如细胞生长、分化、凋亡、器官发育等,也包括肿瘤发生发展。已经发现许多miRNAs在肿瘤中存在异常表达,并且还能发挥癌基因或者抑癌基因的作用。miR-143在多种肿瘤中普遍表达降低,被认为在肿瘤中发挥抑癌基因的作用。miR-143在结直肠癌中的表达及其功能已有一些报道,但是它在结直肠癌肿瘤生长、新的血管形成和耐药中的作用还有待深入阐明。我们收集了62对结直肠癌患者的肿瘤组织和癌旁对照组织,通过定量PCR方法检测了miR-143在组织中的表达情况,并且结合患者的临床信息进行了分析。在结直肠癌肿瘤组织中,miR-143的表达水平显著低于癌旁对照,而且miR-143的低表达水平与肿瘤的Duke’s分期以及淋巴结转移密切相关。我们还检测了41例结直肠癌患者和10例正常人血液中的miR-143水平,与肿瘤组织中的结果相吻合,miR-143在结直肠癌肿瘤病人血液中的含量显著低于正常人。以上这两个实验结果说明miR-143将来有可能用作结直肠癌的早期诊断和预后判断的分子标志物。miRNAs实现其功能的主要方式是通过抑制靶基因的表达,从而调控靶基因参与的生物学功能。miRNAs的靶基因众多,寻找到发挥作用的靶基因对于研究其在肿瘤中的作用至关重要。我们通过生物信息学软件预测发现胰岛素样生长因子-1受体（IGF-IR）和胰岛素受体底物-1（IRS-1）可能是miR-143的靶基因。IGF-IR/IRS-1在结直肠癌中经常过度表达,它们可引发下游多种信号通路发生信号级联反应,其中包括对肿瘤发生发展起重要作用的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）/细胞外调节蛋白激酶（extracelluar regulated protein kinase,ERK）级联信号通路。我们通过荧光素酶报告基因分析和western blotting证实了IGF-IR和IRS-1都是miR-143直接作用的靶基因,并且他们在结直肠癌组织中的表达水平与miR-143的水平呈负相关,这更加说明了miR-143及其靶基因IGF-IR和IRS-1在结直肠癌中可能发挥重要作用。我们构建了稳定表达miR-143的结直肠癌细胞株,逆转了细胞株中原本低表达的miR-143水平,在体外和体内水平研究miR-143对结直肠癌肿瘤形成和新的血管生成的影响。过表达miR-143后,结直肠癌细胞的生长速度减慢,迁移能力减弱,而且IGF-IR/IRS-1下游的PI3K/AKT信号通路活性受到抑制,导致该信号通路中两个重要的信号分子低氧诱导因子-1?（HIF-1?）和血管内皮生长因子（VEGF）表达水平降低。我们实验室的前期研究结果已经表明,HIF-1?和VEGF是肿瘤形成和新的血管生成的重要调节因子。进一步,我们在动物水平上研究miR-143的功能。鸡胚绒毛膜尿囊膜模型（CAM）揭示,过表达miR-143显著抑制了结直肠细胞新的血管生成能力;动物皮下成瘤模型则更直观地表明,过表达miR-143显著抑制了肿瘤的生长速度,减缓了肿瘤的发展进程。在这些研究的基础上,我们更深入地探索了miR-143对结直肠癌的抑制作用是不是通过它的靶基因发挥作用的。通过慢病毒和重组腺病毒分别携带IGF-IR和IRS-1的表达基因进入过表达miR-143的细胞中,从而恢复了被miR-143抑制的IGF-IR和IRS-1水平,结果表明,恢复IGF-IR和IRS-1的表达水平后,HIF-1?和VEGF的表达水平增高,细胞的生长速度和动物皮下肿瘤的生长速度也加快,接近对照组肿瘤的生长速度。肿瘤耐药是影响化疗效果的一大障碍。在化疗过程中,肿瘤往往会产生获得性耐药,从而降低药物的治疗效果。我们在动物水平,首次发现过表达miR-143后,肿瘤细胞对奥沙利铂（oxaliplatin）的敏感性显著增强,给药三天后,肿瘤不断萎缩。在分子水平,我们发现miR-143通过抑制IGF-IR的表达水平,诱导细胞发生凋亡从而增强了肿瘤细胞对奥沙利铂的敏感性。通过本研究,我们发现了miR-143的两个新靶基因,IGF-IR和IRS-1,还发现miR-143通过它的两个靶基因抑制HIF-1?和VEGF的表达从而调控肿瘤形成和新的血管生成,而且增强了结直肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性;通过对临床样本和资料的分析,我们发现了miR-143在结直肠癌肿瘤组织和血液中表达降低,而且还与肿瘤的分期和转移密切相关。这些结果为我们更好地揭示了miR-143在结直肠癌中的作用机制,并且为开发基于miR-143的诊断、治疗和预后手段提供了一定的理论依据。