论文摘要
黄萎病是棉花生产的重要病害，导致棉花的质量与产量下降，影响棉花生产的经济效益。采用生物技术与常规育种方法相结合，分离棉花抗病相关基因，定向培育抗病新品种，是控制病害最简单易行且行之有效的途径。采用RT-PCR方法对受8种病原菌毒素、2种激素处理的棉花幼苗进行检测，分析通过抑制消减杂交、同源克隆等技术所获的22条cDNA序列的表达特性。在所检测的基因中有19个能够被大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）诱导表达，17个能够被黑曲霉（Aspergillus，niger van Tiegh）诱导表达，且GhPR10、GhPRG、GhGT、GhCOX和GhVDRG11能够应答大多数病原菌的侵染，棉花抗黄萎相关基因GhVE1则能够被V.dahliae特异诱导表达。GhPR10、GhLRR、GhGGH和GhVDRG11属于瞬时表达的基因，在10min内即可被检测到：30min～90min范围内共有14个基因被诱导表达。在6h有15个基因共同表达，包括GhVE2、GhEH和受黄萎病菌特异诱导的GhVE1。此外GhEH、GhZFP、GhVE1、GhVE2、GhLRR和GhGGH在军棉1号、中棉12、海7124和L12四个不同抗性品种的表达也存在差异。激素诱导的结果表明，GhPR10能够被SA和ABA诱导表达，GhDIR和参与糖基转移的GhGT受SA诱导表达，ABA上调GhVE1而负调控GhTMR的表达。综合表达特性检测结果，推测棉花对黄萎病的抗性存在两个防御时期，瞬时基础防御和滞后特异性防御。基础防御的基因表达在30min之内已经完成，滞后特异性防御的基因表达在6h形成。GhPR10、GhPRG、GhCPH、GhPDR和GhTMR是瞬时基础防御的核心基因，GhVE1、GhVE2和GhLRR则属于滞后特异性防御基因。ABA和SA主要参与调控基础防御的核心基因和滞后特异性防御基因。采用RACE、TAIL-PCR等技术分离重要的候选基因GhPR10、GhEH、GhPRG、GhZFP、GhERF和GhDIR。GhPR10（DQ123838）cDNA全长774bp，读码框474bp，编码157aa，含有一个108bp内含子，分离到起始密码子上游1537bp，推测为病程相关蛋白Bet vⅠ家族；GhEH（DQ123837）cDNA全长1571bp，读码框1160bp，编码315aa，含有四个内含子，分别为119bp、81bp、83bp和127bp，推测为环氧化物水解酶；GhERF（DQ372577）cDNA全长为1319bp，读码框为1137bp，编码378 aa，推测为乙烯应答元件结合蛋白；GhZFP（DQ372575）cDNA全长为768bp，读码框516bp，编码171 aa，推测为锌指结构蛋白；GhPRG（DQ372577）cDNA全长为序列1020bp，编码264aa，推测为细胞壁组分；GhDIR cDNA全长为序列765bp，编码176aa，推测为与木质化有关的基因。采用农杆菌介导法转化烟草和拟南芥，对GhPR10基因进行功能初步验证，共获得34株GhPR10转基因烟草单株。离体叶片抗病性鉴定表明，GhPR10的过量表达能够明显提高烟草对黄萎病菌的抗性。对转基因烟草叶片的总黄酮含量测定表明，1g风干的GhPR10转基因烟草叶片总黄酮含量最高达1.10mg，平均含量为0.883mg，而对照则只有0.375mg，转烟草总黄酮的含量较对照提高1倍，表明GhPR10能够提高植物抗菌素黄酮类化合物的水平。转基因拟南芥实验也表明，GhPR10能够提高拟南芥对黄萎病菌和盐胁迫的耐受性。此外，GhPR10的表达也能改变烟草和拟南芥的表型，转基因植株生长延缓，转基因拟南芥叶片倾向于横向生长而呈近圆形，顶端优势减弱，侧生茎数量显著增多，表明GhPR10参与调控植物的生长发育。
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标签：棉花抗黄萎病相关基因论文; 表达特性论文; 转基因论文;