论文摘要
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种系统性自身免疫病,以炎性刺激下的滑膜细胞增殖,形成具有侵袭性的血管翳为特点。增殖的滑膜是绒毛状的,伴发众多微小血管。血管翳可以侵袭临近的软骨和骨质,造成关节变形和功能丧失。血管新生（新生血管的出芽过程）发生在RA病理变化中最早期,是血管翳形成的基础,而侵袭性血管翳的发生和发展以至导致软骨、骨质破坏机制一直是RA发病机制和治疗研究的热点。血管新生可以将炎性细胞运送到滑膜组织,同时给血管翳提供氧和营养物质。促进血管新生的因子很多,其中血管内皮生长因子（vascular endothelial cell growth factor,VEGF）是调节生理和病理条件下血管新生的关键因素。VEGF在很多病理状态下的表达升高,可以刺激肿瘤的血管新生和转移。VEGF的单克隆抗体在移植动物模型中抑制肿瘤的生长。这些抗体目前正在进行试验,以期进行肿瘤的治疗。VEGF在RA滑膜衬里细胞和巨噬细胞高度表达,在滑液中表达量也明显升高。有研究表明抑制VEGF表达以后,RA的实验室指标和临床表达都得到改善。这些因素是如何调节VEGF表达的,还有待于进一步阐明。CD147是一种在RA滑膜组织中高度表达的糖蛋白,既往明确它能刺激基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）产生引起关节破坏。MMPs与血管新生息息相关,可以降解血管周围基质,为血管新生消除物理屏障;同时可上调VEGF的表达,促进VEGF的输送。由此推测CD147可能间接对VEGF产生作用,为了深入探讨CD147在类风湿关节炎滑膜中对VEGF表达的调节作用,特设计以下实验内容:1.免疫组织化学染色分析选择15例RA患者滑膜,根据说明书进行SP染色。所有RA病人均符合ACR 1987年修订的分类标准,同时选择4例骨关节炎（ostearthritis,0A）患者做对照。与4例OA滑膜组织CD147和VEGF表达相比,15例RA滑膜组织中均有CD147、VEGF均高表达。其中,表达CD147的细胞主要为成纤维样滑膜细胞、单核-巨噬细胞和淋巴细胞;表达VEGF的细胞主要为成纤维样滑膜细胞、微血管周围成纤维样细胞及血管平滑肌细胞。统计学分析表明VEGF表达与CD147表达间存在正相关。为了观察RA中的血管新生,采用CD31免疫组化染色来观察RA滑膜组织。CD31在血管内皮细胞高度表达,与HE染色下的内皮细胞形态一致。而在对照组的OA滑膜组织中,CD31阳性的内皮细胞很少。提示血管新生在RA滑膜组织中占据重要作用,抑制血管新生可能是治疗RA的一个新方向。2.体外培养成纤维样滑膜细胞成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）来自手术切除的RA患者滑膜组织,剪碎,经0.1%胰酶和0.1%胶原酶Ⅱ,37℃,5%CO2连续消化2 h。用细胞滤网去除组织碎块,收集过滤后的细胞,经PBS洗涤,以含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM（含1mM谷胺酰胺,100U/ml青霉素、100U/ml链霉素）重悬后,接种于75cm2的培养瓶中。24-48h后,去除未贴壁细胞,以后隔日换液,待细胞铺满瓶底后,0.25%胰酶消化,按1:3的比例传代。用PBS洗涤以去除未贴壁细胞。本实验中选用3-5代细胞,比1、2代细胞纯化,同时比5代以后细胞具有更好的生物学功能。FLS经流式（表型:<1% CD14, <1% CD68 and >98% CD90）鉴定。3.流式细胞仪检测FLS细胞表面CD147表达FLS细胞表面的CD147采用流式细胞仪检测。选取细胞,调整浓度至2×105/ml,PBS洗涤后,加入FITC标记的CD147抗体,FITC标记的鼠抗人IgG做对照,避光20分钟。细胞经PBS洗涤后,经流式细胞仪检测。数据结果使用CellQuest软件分析。在使用抗CD147单抗（80mg/L）或LY294002 （20μmol/L）阻断后,FLS细胞表面的CD147表达率明显下降。FLS细胞表面CD147的表达率为（95.60±0.7）%,平均荧光强度为183.56±13.68;使用抗CD147单抗（80mg/L）阻断48 h后,CD147的表达率下降85.76%（P<0.01）;使用LY294002（20μmol/L）阻断48 h后,CD147的表达率下降39.75%（P<0.05）。4.ELISA法检测VEGF选择3-5代的FLS细胞,经不含血清的DMEM洗涤,以2×105 /ml密度种于24孔板中,经不含血清DMEM培养后24小时分别加入抗CD147单抗、LY294002、PD98059、SP600125和SB203580,所有的实验做3复孔或4复孔。根据ELISA说明书检测培养上清中的VEGF。于96孔板中加入0.4 g/ml羊抗人VEGF100μl/孔。4℃过夜,加入1%牛血清清蛋白室温封闭1小时,最后分别加入标准品及待测样品室温孵育1.5小时。加入TMB/H O后发生显色反应,30分钟后终止。使用ELISA自动读数仪于450nm处测量吸光度（OD）值。绘制标准曲线,根据标准曲线得出相应的VEGF浓度。在使用抗CD147单抗（80mg/L）或LY294002 （20μmol/L）后,FLS细胞培养上清中VEGF表达水平明显下降。加入MAPK阻断剂（PD98059、SP600125和SB203580）组对VEGF表达水平无统计学意义（P>0.05）。加入抗CD147单抗阻断剂及LY294002阻断剂组VEGF水平变化如表1所示。加入抗CD147单抗的FLS上清中VEGF的表达浓度在第6、12、24、48 h,分别减少了67.28%,67.68%,67.90%,67.67%（P<0.05）。加入LY294002阻断剂的FLS上清中VEGF的表达浓度在12、24、48 h分别减少了58.17%,79.29%,92.62%（P<0.05）。5.RT-PCR检测VEGF mRNA使用Trizol法提取FLS细胞中的mRNA,经cDNA逆转录后PCR扩增,使用GAPDH作为内参照,最后1.5%凝胶电泳成像分析。抗CD147单抗的抑制试验中发现,使用抗CD147单抗（80mg/L）处理FLS细胞后0、6、12、24、48h的VEGF cDNA的表达明显减弱。RA是以关节破坏为特点的一种慢性炎性疾病,血管翳是其滑膜侵袭和骨质破坏中的重要机制。在RA中高度表达的VEGF可刺激血管翳形成,促进血管新生,推进软骨和骨质的侵袭。而另一种高度表达的分子EMMPRIN/CD147通过刺激MMPs分泌,也在局部侵袭和血管新生中发挥重要作用,由此推测CD147和VEGF间可能有某种联系, RA中FLS细胞同时表达CD147和VEGF的意义也值得研究。本研究发现,在RA滑膜组织中表达CD147的细胞主要为成纤维样滑膜细胞、单核-巨噬细胞和淋巴细胞,表达VEGF的细胞主要为成纤维样滑膜细胞、微血管周围成纤维样细胞及血管平滑肌细胞,这些都是血管翳形成,软骨和骨质破坏的基础。使用抗CD147单抗或PI3K-Akt阻断剂（LY294002）可以阻断这一过程。提示CD147-VEGF可以作为RA关节破坏的一个潜在治疗靶点。总之,我们发现CD147可以通过PI3K-Akt信号通路上调VEGF;CD147表达水平降低后,FLS细胞的VEGF产量随之减少。CD147是RA发病机制中重要的调节因子,不仅作为EMMPRIN刺激MMPs的产生,还可以通过调节VEGF促进RA中的血管新生。阻断CD147可以减少RA中新生血管的形成、软骨侵袭和骨质破坏。
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标签：关节炎论文; 类风湿论文; 血管内皮生长因子论文;