短小芽孢杆菌组成型高效表达分泌系统的建立与应用

论文摘要

利用天然的或经过遗传改良的微生物进行植物病虫害的防治是目前国际上较为活跃的研究领域，尤其是利用植物本身根系和叶围正常存在的微生物进行外源抗病虫害基因的转化，可使外源基因产物持续作用于植物表面，赋予植物抗病虫害的能力，避免或减少因使用化学农药对环境造成的污染。芽孢杆菌是重要的生防微生物，已有越来越多的研究表明，芽孢杆菌对植物的多种病原真菌、细菌和昆虫有抑制效果。本实验室从水稻叶片上分离出一株附生菌——短小芽孢杆菌DX01，它与水稻有良好的亲和性，经实验证明该菌具有天然拮抗某些真菌的特性，为了进一步将其定向改造成具有强抗真菌能力的工程菌，我们对该菌进行了一系列的研究工作。采用PCR技术，亚克隆了来自短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）DX01菌株总基因组的启动子活性片断F1，并构建了大肠杆菌一短小芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300-Flgfp，以缺失启动子的绿色荧光蛋白（GFP）基因为报告基因，通过荧光激活细胞分检分析，检测了启动子F1在短小芽孢杆菌DX01中的转录活性和转录阶段。结果表明启动子F1在短小芽孢杆菌DX01中有强的转录活性，是一个高效营养组成型启动子。为了构建短小芽孢杆菌DX01的组成型表达分泌载体，以大肠杆菌β-内酰胺酶为报告蛋白，检测了枯草芽孢杆菌蛋白酶和果聚糖蔗糖酶信号肽以及短小芽孢杆菌DX01核糖核酸酶信号肽在短小芽孢杆菌DX01中驱动蛋白分泌的能力。研究结果表明这三个信号肽均能引导β-内酰胺酶从DX01细胞中分泌，但含有枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽的DX01能分泌比其他两个更多的β-内酰胺酶到细胞外；枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶和DX01核糖核酸酶的信号肽也能引导GFP从DX01细胞中分泌。采用RT-PCR的方法，克隆了萝卜抗真菌蛋白1（Rs-AFPl）的cDNA全长，将去掉信号肽序列的Rs-afp1基因与终止密码子突变掉的绿色荧光蛋白（GFP）基因进行融合，并在其后加上T7终止子，连在枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽序列后面，构建成GFP-AFP1融合蛋白穿梭表达分泌载体pHY300-F1LgAFP1；将去掉信号肽的序列的Rs-afp1基因在其后加上T7终止子，连在枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽序列后面，构建成穿梭表达分泌载体pHY300-FILAFP1。Western杂交证实融合蛋白GFP-AFP1在短小芽孢杆菌DX01中能够表达、分泌；工程菌DX01（pHY300-F1LAFPl）的抗真菌活性增强，说明萝卜抗真菌蛋白1在短小芽孢杆菌中能够有活性地表达和分泌。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述
• 1 植物病虫害的生物防治
• 2 植物病虫害微生物防治的研究进展
• 2.1 植物病害的微生物防治
• 2.2 植物虫害的微生物防治
• 3 基因工程技术在生防微生物遗传改良中的应用
• 3.1 微生物抑菌机制的研究和抗性基因的克隆
• 3.2 抗性基因在其他细菌中的表达
• 3.3 抗性基因的遗传改造
• 3.4 微生物生防工程菌株的示踪
• 引言
• 第一章 利用绿色荧光蛋白（GFP）探测启动子F1在短小芽孢杆菌DX01中转录活性与转录阶段的研究
• 1 材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要的仪器和设备
• 2 方法
• 2.1 细菌培养条件
• 2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.3 大肠杆菌的转化
• 2.4 大肠杆菌小量质粒的提取
• 2.5 质粒及PCR产物的酶切反应
• 2.6 酶切产物的回收与连接
• 2.7 短小芽孢杆菌的电击转化
• 2.8 短小芽孢杆菌DX01菌株基因组DNA的提取
• 2.9 短小芽孢杆菌DX01菌株质粒的提取
• 2.10 短小芽孢杆菌组成型启动子活性片段F1的亚克隆与gfp基因的克隆
• 2.11 gfp基因组成型穿梭表达载体pHY300-F1gfp的构建与转化
• 2.12 荧光检测
• 2.13 短小芽孢杆菌DX01（pHY300-F1gfp）细胞群的荧光激活细胞分检分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 短小芽孢杆菌DX01启动子pCP01功能片段F1的亚克隆
• 3.2 含表达载体pHY300-F1gfp的短小芽孢杆菌荧光检测
• 3.3 含gfp基因表达载体的短小芽孢杆菌DX01的流式细胞仪荧光激活细胞分检分析
• 第二章 枯草芽孢杆菌蛋白酶、果聚糖蔗糖酶信号肽及短小芽孢杆菌核糖核酸酶信号肽在DX01中引导外源蛋白分泌的能力的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 枯草芽孢杆菌168菌株基因组DNA的提取
• 1.2.2 短小芽孢杆菌DX01核糖核酸酶及其信号肽序列的克隆
• 1.2.3 枯草芽孢杆菌蛋白酶和果聚糖蔗糖酶信号肽序列的克隆
• 1.2.4 大肠杆菌成熟β-内酰胺酶序列的克隆
• 1.2.5 在启动子F1控制下短小芽孢杆菌DX01β-内酰胺酶表达分泌载体的构建
• 1.2.6 短小芽孢杆菌DX01β-内酰胺酶活性的测定
• 1.2.7 GFP组成型表达分泌载体pHY300-F1Lgfp及pHY300-F1Rgfp的构建
• 1.2.8 GFP在短小芽孢杆菌DX01中表达、分泌的免疫印迹检测
• 2 结果与分析
• 2.1 短小芽孢杆菌DX01核糖核酸酶及其信号肽序列的克隆
• 2.2 枯草芽孢杆菌蛋白酶和果聚糖蔗糖酶信号肽序列的克隆
• 2.3 大肠杆菌成熟β-内酰胺酶序列的克隆
• 2.4 短小芽孢杆菌DX01（pHY300-F1RBla）、DX01（pHY300-F1SBla）和DX01（pHY300-F1LBla）β-内酰胺酶活性的测定
• 2.5 GFP在短小芽孢杆菌DX01中表达、分泌的免疫印迹分析
• 2.6 小结与讨论
• 第三章 萝卜抗真菌蛋白1（Rs-AFP1）在短小芽孢杆菌DX01中表达、分泌的研究
• 1 材料
• 1.1 萝卜品种
• 1.2 真菌菌种
• 1.3 细菌与载体
• 1.4 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 萝卜种子培养条件
• 2.2 真菌培养条件
• 2.3 萝卜幼苗总DNA抽提方法
• 2.4 萝卜幼苗总RNA的提取
• 2.4.1 RNA提取过程中的注意事项
• 2.4.2 提取方法
• 2.5 Rs-afp1 cDNA第一链的合成
• 2.6 RT-PCR扩增Rs-afp1 cDNA
• 2.7 表达分泌穿梭载体pHY300-F1LgAFP及pHY300-F1LAFP的构建
• 2.8 GFP融合蛋白在短小芽孢杆菌DX01中表达、分泌的免疫印迹检测
• 2.9 工程菌DX01（pHY300-F1LAFP1）对病原真菌的拮抗作用
• 3 结果与讨论
• 3.1 Rs-afp1基因cDNA片断的RT-PCR克隆
• 3.2 GFP-Rs-AFP1融合蛋白在短小芽孢杆菌DX01中表达、分泌的免疫印迹检测
• 3.3 工程菌DX01（pHY300-F1LAFP1）对病原真菌的拮抗作用
• 参考文献
• 发表文章
• 致谢