枫香基因转化体系的研究以及枫香AGAMOUS基因的初步功能分析

论文摘要

枫香（Liquidambar formosana Hance.）是我国乡土树种,分布于淮河长江流域以南地区。由于其生长迅速,抗逆性强,秋叶红色鲜艳可爱,是我国亚热带地区的典型秋色叶树种,故而在长江流域以南地区被广泛用作公路、街道、庭院和工厂绿化树种。但是在城市园林应用过程中,枫香球果存在数量多、个体大、果实硬、不易降解等问题,球果掉落时易砸伤行人及车体,给市民出行带来不便,同时也给城市环境造成了一定的污染。针对这种情况,利用基因工程培育无球果枫香成为一种行之有效的解决方法。本研究首先建立了枫香的离体微繁及植株再生体系,对影响枫香叶片再生植株的不同因素进行了系统的探讨,并在此基础上对根癌农杆菌介导枫香的遗传转化条件作了初步探索,为枫香的基因工程改良奠定了一定的基础。同时,根据拟南芥花器官发育AGAMOUS（AG）基因控制雄蕊和心皮发育的功能,我们克隆了枫香的AG同源基因LfAG,并进行了初步功能研究,最终以通过转基因抑制枫香内源AG基因的表达,获得无球果枫香为研究目的。主要结果如下:1.以优良枫香无性系的带芽茎段为外植体,建立了枫香的离体微繁体系。结果表明:将带芽茎段消毒后接种在WPM+0.1mg/LNAA+0.75 mg/L BA培养基上,诱导腋芽萌发效果最好;将萌发的幼芽切下接种在WPM+0.01mg/L NAA+0.5 mg/LBA或者WPM+0.01mg/LNAA+0.5mg/L BA+0.3 mg/LGA3培养基上,可分别获得5.25和4.17的增殖系数以及2.57cm和2.90cm的芽丛平均高度;对比了IAA和NAA对枫香试管苗不定根的诱导效果,NAA诱导的不定根为粗短型,数量多,无二级侧根;WPM+2.0mg/L IBA诱导的不定根为细长型,根系丰富,二级侧根发达,适合作为枫香试管苗不定根诱导的培养基;将根系发育良好的再生植株移栽后,成活率可达100%,植株生长和外观形态均表现正常;2.建立了枫香叶片的植株再生体系。以5个基因型试管苗叶片为外植体,研究了NAA和TDZ对不定芽分化的作用,确定了5个基因型再生频率都较高的通用培养基为WPM+0.05mg/L NAA+0.25 mg/LTDZ,最高的再生率可达90%,平均每叶片再生3.11个不定芽;基因型P13不定芽分化的能力较差,其最高的不定芽分化率仅为32.6%,与其它4种基因型存在显著性差异（平均再生率为53.2%—90%）;光照条件对枫香叶片再生有很大的影响,最合适的光照条件为暗培养7d后转入弱光下培养;试管苗顶端第1—2片叶分化能力最强,第3—4片叶的再生能力有所下降,但仍有70%以上的再生率;3.以枫香叶片为材料,确定了其作为遗传转化受体系统的选择压力。结果表明,20mg/L的卡那霉素即可导致枫香叶片失去分化能力,15mg/L的卡那霉素即可导致枫香试管苗失去不定根分化能力。300mg/L的头孢霉素作为抑菌剂,对不定芽和不定根的分化能力均影响不大;4.以枫香叶片为受体,对根癌农杆菌介导的遗传转化条件进行了摸索。结果发现,卡那霉素对枫香侵染叶片的再生具有明显的抑制作用,共培养后直接转入选择培养外植体的再生能力急剧下降。但根据GFP基因瞬间表达的结果可知,预培养3天的叶片有利于农杆菌的附着和侵染;共培养基中AS的添加易导致叶片切口的褐化,因此在枫香遗传转化中不宜添加。对枫香叶片而言,以AB液体培养基作为侵染液,侵染10min,共培养4天的条件下进行转化,GFP表达状态最好,最有利于T-DNA的转移;5.利用同源克隆法,得到了枫香AG同源基因LfAG的全长CDS。根据GenBank中公布的美国枫香LAG基因cDNA序列设计引物,利用反转录PCR技术获得了枫香LfAG基因的全长CDS。该序列与美国枫香LAG基因核苷酸序列同源性高达98.6%,氨基酸序列同源性为96.0%,具有完整的MADS区和K区,C区具有2个AG基因的保守Motif;6.在载体pCAMBIA2300S、pART27、pHELLSGATE2的基础上,分别构建了LfAG基因的正义、反义重复和RNAi植物表达载体。利用上述3种构建转化烟草,获得的转化反义重复载体抗性植株59株和RNAi抗性植株60株均已经开花。转p2300s-LA载体的烟草抗性植株目前正在培养基中进行筛选。目前,重复反义载体转基因烟草植株已经获得了多种目的表型,包括花药花瓣化,雄蕊一端形成异域柱头和副雌蕊的形成等。此外,与野生型相比,多数转基因植株出现花药开裂推迟或者不裂的现象。各种表型的形成原因还有待于进一步分析。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写名词表
• 第一章 文献综述
• 前言
• 1.1 木本植物组织培养的发展概况
• 1.2 TDZ在木本植物组织培养中的应用
• 1.3 木本植物基因工程研究进展
• 1.3.1 根癌农杆菌介导的遗传转化机理
• 1.3.2 影响根癌农杆菌介导木本植物基因转化的因素
• 1.4 利用基因工程创造不育植株的研究进展
• 1.5 MADS-box基因家族和花器官发育的ABC模型
• 1.5.1 MADS-box基因家族
• 1.5.2 经典的ABC模型及其发展
• 1.5.3 四聚体模型
• 1.6 AGAMOUS（AG）基因研究进展
• 1.6.1 AG基因的结构和同源基因的克隆分析
• 1.6.2 AG基因的表达调控
• 1.7 植物基因功能研究策略
• 1.7.1 基因功能丧失方法
• 1.7.2 基因功能增加方法
• 1.8 枫香属植物生物技术及育种研究进展
• 1.9 研究方案以及本研究内容
• 第二章 枫香基因转化受体系统的建立及基因转化初探
• 2.1 引言
• 2.2 枫香离体快繁体系的建立
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 培养条件
• 2.2.4 腋芽萌发
• 2.2.5 试管苗增殖
• 2.2.6 试管苗生根
• 2.2.7 试管苗移栽
• 2.3 枫香叶片植株再生体系的建立
• 2.3.1 植物材料
• 2.3.2 植株再生
• 2.3.3 基因型对叶片再生的影响
• 2.3.4 影响叶片再生的其它因素
• 2.4 枫香的抗生素敏感性试验
• 2.4.1 抗生素
• 2.4.2 枫香叶片对卡那霉素（Kan）的敏感性实验
• 2.4.3 抑菌剂头孢霉素（Cef）对枫香叶片不定芽再生的影响
• 2.4.4 Kan与Cef组合对枫香叶片不定芽再生的影响
• 2.4.5 试管苗增殖过程中对Kan的敏感性试验
• 2.4.6 Kan对试管苗生根的影响
• 2.5 枫香遗传转化初探
• 2.5.1 植物材料
• 2.5.2 根癌农杆菌菌株及质粒
• 2.5.3 根癌农杆菌介导的基因转化过程
• 2.6 结果与分析
• 2.6.1 枫香试管苗无性系及微繁体系的建立
• 2.6.2 枫香叶片不定芽再生体系的建立
• 2.6.3 卡那霉素Kan选择压力的确定
• 2.6.4 抑菌剂头孢霉素Cef浓度的确定
• 2.6.5 枫香基因转化体系初探
• 2.7 问题与讨论
• 2.7.1 基本培养基的选择
• 2.7.2 关于长期继代激素累积对枫香无菌苗快繁的影响
• 2.7.3 TDZ对枫香不定芽伸长的抑制作用
• 2.7.4 光照条件对枫香叶片再生的影响
• 2.7.5 木本植物试管苗的移栽成活的关键技术
• 2.7.6 转化细胞再生的问题
• 2.7.7 选择策略的问题
• 2.7.8 T-DNA在植物基因组中的整合
• 2.8 下一步工作
• 第三章 枫香AGAMOUS基因在烟草中的初步功能分析
• 3.1 引言
• 3.2 植物材料
• 3.3 菌株、质粒、试剂
• 3.4 试验方法
• 3.4.1 枫香花芽的总RNA提取
• 3.4.2 cDNA第一链合成
• 3.4.3 枫香AGAMOUS基因的克隆与序列分析
• 3.4.4 质粒DNA的提取
• 3.4.5 植物表达载体构建
• 3.4.6 农杆菌的转化
• 3.4.7 烟草的遗传转化
• 3.4.8 转基因植株和未转基因植株的形态比较
• 3.5 结果与分析
• 3.5.1 枫香花芽总RNA提取
• 3.5.2 枫香AG同源基因的克隆与序列分析
• 3.5.3 LfAG基因的植物表达载体构建
• 3.5.4 转基因卡那霉素抗性烟草植株的获得
• 3.5.5 转基因烟草植株的PCR检测
• 3.5.6 转基因烟草突变体的表型分析
• 3.6 讨论
• 3.6.1 枫香花芽总RNA提取方法的探讨
• 3.6.2 pART-2LA载体转基因植株花器官变异的可能成因
• 3.6.3 不同T-DNA结构的LfAG基因的转基因效率问题
• 参考文献
• 附录
• 致谢