p53选择性调控分子Apak在不同类型应激条件下的功能调控及其分子机制

论文摘要

p53是调控细胞周期进程及凋亡发生的蛋白网络的重要节点分子,它作为一种重要的转录因子,在感应DNA损伤、细胞异常增殖和原癌基因激活等不同类型的细胞应激时,其活性迅速增强,能够诱导细胞周期阻滞和/或细胞凋亡的发生。KRAB锌指蛋白（又称作KZNF）家族是哺乳动物中最大的转录调控因子家族,Apak（ATM and p53 associated KZNF protein）是这个家族中的成员之一。Apak作为本实验室发现的一种p53负调控分子,能够选择性地下调凋亡相关的p53靶基因表达,抑制p53介导的细胞凋亡,而对细胞周期没有显著调控作用。在非应激条件下Apak通过募集KAP-1/HDAC1/ATM复合物抑制p53的乙酰化,从而发挥对p53的负调控功能。而在DNA损伤条件下,Apak被ATM磷酸化并因此与p53解离,解除对p53的抑制,促使p53激活,诱导细胞凋亡发生。癌基因的激活是一类重要的p53诱导信号,也是导致肿瘤发生的重要因素,其信号转导机制不同于DNA损伤信号通路。目前已知,癌基因激活后很大程度上是通过上调抑癌基因p14ARF的转录水平和/或活性而间接诱发p53激活的。本实验室新近克隆和鉴定了Apak基因,但目前关于Apak基因的研究报道还非常少,它在不同类型细胞应激条件下的调控机制也还很不清楚。为此,本论文研究了Apak在癌基因激活及多种化疗药物造成的DNA损伤这两大类细胞应激条件下的功能调控及其分子机制。取得了以下结果:1.在癌基因激活条件下Apak功能的变化（1）在利用过表达c-MYC、E2F1、Ras-G12V模拟的原癌基因激活条件下,Apak和p53发生解离并且解除了对p53的抑制,且这些过程依赖于p14ARF,但不依赖于ATM介导的磷酸化。（2）蛋白相互作用实验显示,p14ARF与Apak在体内体外均可结合,且p14ARF能够与p53竞争性的结合Apak,从而诱发p53与Apak解离。同时还发现,原癌基因激活可诱导Apak蛋白稳定性显著增加,且依赖于p14ARF的表达。（3）Apak为短寿命蛋白,其稳定性受到泛素蛋白酶体系统的调节,泛素连接酶（E3）HDM2和ARF-BP1参与了Apak泛素化降解,而原癌基因激活可诱导p14ARF上调表达,后者抑制了这两种E3对Apak的降解作用,从而增强其蛋白的稳定性。（4）敲低HDM2和ARF-BP1的表达,可干扰p14ARF诱导的Apak上调。这些结果揭示了一条从原癌基因激活到p14ARF再到Apak的信号转导通路。2.在7种不同的化疗药物处理下Apak的功能变化发现在经典的DNA损伤信号如顺铂（cisplatin）、阿霉素（doxorubicin）、鬼臼亚乙苷（etoposide）、喜树碱（camptothecin）处理下,Apak能够被ATM磷酸化并与p53解离。而5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）、放线菌素D（actinomycin D）和硫辛酸（α-lipoic acid,α-LA）则没有这样的效应。这表明Apak响应特定类型的DNA损伤信号。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 P53 蛋白的研究进展
• 1 P53 上游的调控网络
• 2 P53 的中游调控网络
• 2.1 MDM2 与p53
• 2.2 p14ARF 与p53
• 2.3 其它蛋白质的相互作用对p53 的调控
• 3 P53 的下游功能网络
• 3.1 p53 促进细胞凋亡
• 3.2 p53 介导的细胞周期阻滞
• 3.3 p53 参与DNA 损伤的修复，维持基因组的完整性
• 4 小结
• 第二章 原癌基因C-MYC、E2F1、RAS 与肿瘤关系的研究进展
• 1 原癌基因C-MYC 基因的研究
• 1.1 c-MYC 癌基因的结构
• 1.2 c-MYC 基因表达产物的结构与功能
• 1.3 c-MYC 癌基因激活机制
• 1.4 c-MYC 癌基因与细胞周期及细胞凋亡的关系
• 1.5 小结
• 2. 原癌基因E2F1 基因的研究
• 2.1 E2F 转录因子家族成员
• 2.2 E2F 与肿瘤的关系
• 2.3 E2F1 与细胞增殖的关系
• 2.4 E2F 与细胞凋亡
• 2.5 小结
• 3 原癌基因RAS 的研究
• 3.1 Ras 基因的结构
• 3.2 Ras 蛋白的功能
• 3.3 Ras 与肿瘤的关系
• 3.4 Ras 基因与细胞凋亡的关系
• 3.5 小结
• 第三章 P14ARF 的研究进展
• 1 P14ARF 基因的结构
• 2 P14ARF 的生化功能
• 2.1 p14ARF-HDM2-p53 通路的研究
• 2.2 p14ARF-ARF-BP1-p53 通路的研究
• 2.3 p14ARF 非依赖于p53 通路的研究
• 2.4 p14ARF 与蛋白酶体作用研究
• 2.5 p14ARF 对其它蛋白的调控
• 3 小结
• 第四章 泛素-蛋白酶体介导的蛋白质降解机制的研究进展
• 1 泛素-蛋白酶体途径（UPP）
• 1.1 泛素（ubiquitin）
• 1.2 蛋白酶体
• 1.3 泛素-蛋白酶体系统的作用机制
• 1.4 去泛素化酶系统
• 2 UPP 与疾病
• 3 小结
• 实验研究
• 第五章 原癌基因激活对APAK 功能的调控及其分子机制
• 第一节 原癌基因激活对APAK 转录抑制功能的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 Ras 及Ras-G12V 表达载体构建
• 2.2 多种癌基因信号刺激下，Apak 抑制p53 转录因子活性的变化
• 2.3 多种癌基因信号刺激下，Apak 与p53 结合的变化
• 2.4 Apak 568A 突变不能阻断癌基因激活下Apak 和p53 的解离
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二节 P14ARF 对APAK 功能的调控
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 p14ARF 敲低可阻断癌基因激活对Apak 转录抑制功能的负调控同时导致癌基因激活不能诱导Apak-p53 解离
• 2.3 p14ARF 的N 端能够拮抗Apak 对p53 的转录抑制活性
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三节 APAK 与P14ARF 的相互作用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 GST-p14ARF、GST-p14ARF-N64、GST-p14ARF-ΔN64 质粒的构建
• 2.2 p14ARF 和Apak 的体外相互作用
• 2.3 p14ARF 的N 端46-64 aa 区域决定了其与Apak 的结合
• 2.4 Apak 的C 端锌指结构决定了其与p14ARF 的结合
• 2.5 p53 与p14ARF 竞争性的结合Apak
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四节 癌基因应激上调APAK 的蛋白稳定性且依赖于P14ARF
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 癌基因c-MYC、E2F1、Ras-G12V 上调外源Apak 的表达
• 2.2 癌基因调控Apak 的蛋白水平依赖p14ARF
• 2.3 p14ARF 可以增强Apak 的蛋白稳定性
• 3 讨论
• 4 小结
• 第五节 泛素连接酶HDM2 对APAK 稳定性的调控
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 p14ARF 抑制蛋白酶体介导的Apak 降解
• 2.4 HDM2 通过蛋白酶体途径对Apak 的蛋白水平进行下调
• 2.6 HDM2 与Apak 的相互作用
• 2.5 p14ARF 与HDM2 竞争性的结合Apak
• 3 讨论
• 4 小结
• 第六节 泛素连接酶ARF-BP1 对APAK 稳定性的调控
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 2 结果
• 2.1 ARF 调控Apak 稳定性依赖ARF-BP1 和HDM2 两种E3 的存在
• 2.3 原癌基因调控Apak 稳定性也依赖ARF-BP1 和HDM2 两种E3 的存在
• 3 讨论
• 4 小结
• 第六章 不同类型的DNA 损伤信号对APAK 的调控及机制
• 第一节 多种DNA 损伤信号对APAK 转录抑制功能的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1.p 53 激活信号的选择
• 2.2 DNA 损伤药物处理后，Apak 抑制p53 转录活性的变化
• 2.3 DNA 损伤处理后，Apak 磷酸化水平及p53 凋亡靶基因的变化
• 2.4.D NA 损伤处理后，Apak 磷酸化水平的时相变化
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二节 多种DNA 损伤信号处理下APAK 与P53 的结合变化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1. DNA 损伤因素处理后，Apak 与p53 结合的变化
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三节 多种DNA 损伤信号处理下APAK 与ATM 的相互作用变化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1. ATM 与Apak 可以在体内结合，并在doxorubicin、etoposide、camptothecin、cisplatin 处理后解离
• 2.2. DNA 损伤诱导的Apak-p53 解离依赖ATM 激酶
• 3 讨论
• 4 小结
• 第七章 结论与创新点
• 结论
• 1 原癌基因激活对APAK 功能的调控及其分子机制
• 1.1 原癌基因激活对Apak 转录抑制功能的影响
• 1.2 p14ARF 对Apak 功能的调控
• 1.3 Apak 与p14ARF 的相互作用
• 1.4 癌基因应激上调Apak 的蛋白稳定性且依赖于p14ARF
• 1.5 泛素连接酶HDM2 对Apak 稳定性的调控
• 1.6 泛素连接酶ARF-BP1 对Apak 稳定性的调控
• 2 不同类型的DNA 损伤信号对APAK 的调控及机制
• 2.1 多种DNA 损伤信号对Apak 转录抑制功能的影响
• 2.2 多种DNA 损伤信号处理下Apak 与p53 的结合变化
• 2.3 多种DNA 损伤信号处理下Apak 与ATM 的相互作用变化
• 创新点
• 参考文献
• 主要仪器设备和常用试剂的配制
• 英文缩写词
• 致谢
• 作者简介