论文摘要
目前,胚胎干细胞的研究主要集中在分离纯化、扩增技术和定向诱导分化几个方面。本研究以胚胎干细胞作为研究对象,研究内容共分以下两部分:第一部分主要是猪胚胎生殖细胞（EG）的分离培养研究。本实验室采用STO细胞作饲养层,在培养基中添加分化抑制因子的方法,已成功分离培养获得猪的EG细胞。为进一步探索猪EG细胞更为理想的培养体系,并获得能够稳定传代的EG细胞系,第一部分以三个实验展开了对猪EG细胞体外培养条件的进一步研究。实验一研究了条件培养基对猪EG细胞分离培养的影响。在原代分离猪PGCs的过程中,可以同时分离获得猪胎儿成纤维细胞（PEF）和胎儿心脏成纤维细胞（EHF）;经培养纯化后,提取这两种细胞的RNA并反转录;RT-PCR检测结果表明,PEF和EHF中均表达猪的LIF基因。因此,分别收集两种细胞的培养液制成条件培养基,用来培养猪的EG细胞。分别使用两种条件培养基或将条件培养基与STO饲养层细胞联合使用来分离培养猪的EG细胞,结果发现条件培养基必须与饲养层细胞联合使用,才能维持EG细胞的增殖未分化状态。实验二研究了Knockout培养基对猪EG细胞分离培养的影响。本实验共分三组,其中实验组I为Knockout DMEM与Knockout SR组成的Knockout培养基,实验组II为Knockout DMEM/F-12+15%FCS的低渗培养基,对照组为DMEM+15%FCS的普通培养基,三个实验组中均添加了细胞生长因子。结果表明实验组I与对照组都可以获得能够传代的EG细胞,实验组I培养效果好于对照组;而实验组II不能维持EG细胞稳定传代。因此,Knockout DMEM与Knockout SR组成的Knockout培养基可以用于分离培养猪的EG细胞。实验三将PGCs与同源胎儿成纤维细胞共培养分离培养猪的EG细胞。培养获得的细胞经AKP染色,SSEA-1免疫荧光染色,转录因子Oct-4免疫荧光表达,核型分析,体外分化实验及电镜观察等多种方法进行鉴定,证明其具有胚胎干细胞的特征。因此,PGCs与同源胎儿成纤维细胞共培养的方法可以用于分离培养猪EG细胞。第二部分以小鼠ES细胞作为研究对象,分三个实验对不同诱导剂在胚胎干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞（IPCs）中的作用以及基因转染方法诱导ES细胞分化为IPCs进行了初步探讨。实验一研究了GLP-1在诱导小鼠ES细胞向IPCs分化中的作用。诱导一周后,经DTZ染色鉴定,阳性细胞很少;诱导两周后,提取细胞总RNA,经RT-PCR检测发现,GLP-1可以使与胰腺发育相关的重要基因Pdx1的表达量上调,但诱导两周仍未能获得大量IPCs。实验二研究了bFGF在诱导小鼠ES细胞向IPCs分化中的作用。诱导后提取细胞总RNA,通过RT-PCR未能检测到IPCs相关基因的表达。实验结果表明,在本实验条件下,向培养基中单一添加bFGF并不能有效地诱导小鼠ES细胞向IPCs分化。实验三采用基因转染的方法将Pdx1基因与Isl1基因导入小鼠ES细胞诱导其分化。转染24h后,通过RT-PCR的方法检测到Pdx1基因与Isl1基因在小鼠ES细胞中过表达,其中Pdx1表达量明显上调,但是仍未检测到其它IPCs相关基因的表达。这一结果表明,转染时间不够,转染24h后过表达的基因未能诱导小鼠ES细胞的分化。但是由于过表达效果明显,如果添加其他诱导剂在培养基中,继续传代培养,将会有比较好的诱导结果。