论文摘要
鸭腺病毒1型（Duck adenovirus type 1,DAV1）病毒是包含产蛋下降综合症病毒（Egg drop syndrome virus,EDSV）或类似EDSV的一种无囊膜的双股DNA禽腺病毒,属于腺胸腺病毒属（Atadenovirus）,与禽腺病毒Ⅰ群（CELO）病毒存在很小的共同抗原。选用无致病力的DAV1病毒构建的重组疫苗,既具有感染细胞谱广、不整合到染色体、可刺激机体产生强烈的粘膜免疫等优点,又避免了因CELO病毒隐性感染引起的免疫效力的干扰。但是目前对DAV1病毒的复制非必需区及外源基因插入容量的了解很少,严重阻碍了将其作为病毒载体的应用。为了方便进一步研究DAV1病毒的基因结构与功能,本文通过基因组的限制性内切酶分析以及动物实验,筛选了一株低毒力的DAV1病毒QU,利用Cre/loxP系统,通过位点特异性重组将细菌人工染色体（BAC）插入DAV1病毒QU株基因组中,构建了其感染性全基因组克隆。首先以一株来源于鹌鹑的DAV1病毒QU株为材料,提取其基因组DNA,分别用限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、EcoRV、KpnⅠ和Eam1105Ⅰ进行消化。琼脂糖凝胶电泳显示除了EcoRⅠ,其余4种酶切产物都与已报道的DAV1病毒AV127株的全序列分析结果不同。这表明病毒QU株与鸡源DAV1病毒的基因型有较大不同。为了确定其致病性,分别用病毒QU株和鸡源DAV1病毒HS株对20日龄SPF鸡进行攻毒。4天后检测其血清生化指标的变化情况并与对照组进行比较,同时取其肝脏进行病理组织学观察。发现QU组的各项生化指标均没有明显变化,肝组织形态与对照组相同;HS组的谷草转氨酶、碱性磷酸酶、胆碱脂酶和血淀粉酶显著降低,总蛋白、白蛋白和球蛋白极显著降低,并且肝细胞大量坏死。结果表明,HS株病毒主要引起鸡肝脏和胰腺的损伤,具有较强的致病性;QU株病毒对雏鸡的生理状况几乎没有影响,毒力很弱,可以用作禽用基因疫苗或基因治疗的候选病毒载体。随后,本研究通过双酶切,将一段两端各有一个loxP位点的绿色荧光蛋白（GFP）表达盒插入到质粒pAD20与QU病毒基因组同源的序列中,构建了转移质粒载体pADloxH。采用脂质体介导法,将重组质粒pADloxH与QU株基因组共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,用96孔板稀释法筛选纯化表达GFP的重组病毒Vgfp。将其与Cre重组酶质粒pCre共转染CEF,筛选纯化GFP阴性的重组病毒Vlox。将病毒vlox与质粒plndigoBAC-5和pCre共转染CEF,利用X-gal筛选lacZ阳性的重组病毒Vbac。提取病毒vBAC基因组DNA,通过CaCl2法转化大肠杆菌DH10B,获得质粒pVbac。用EcoRⅠ酶切质粒pVbac和病毒QU株基因组,琼脂糖凝胶电泳检测发现酶切产物与预期结果一致,表明质粒pVbac中包含了病毒QU株的基因组。通过脂质体介导,用质粒pVbac转染CEF,观察细胞病变情况发现,转染3天后细胞出现可见病变:细胞折光性增强,出现核内包涵体,逐渐变大,最后变圆并脱落。结果显示质粒pVBAC是具有感染性的。本研究获得的DAV1病毒QU株感染性全基因组BAC克隆,使得对病毒基因组的突变分析更加方便、准确。